骨髓間充質(zhì)干細胞及其來源的微泡對慢性腎損傷體內(nèi)外修復作用的研究.pdf

1、研究一MSC、MSC-MV抑制由TGF-β1誘導的HK-2纖維化實驗
　　目的:骨髓間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新、多向分化和高度增殖功能的細胞。間充質(zhì)干細胞的移植能夠明顯改善腎臟功能，它可能是參與腎小管修復和腎功能恢復的主要細胞群體。而從骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)中提取的微泡(Micro-Vesicles，MVs)具有促進受損腎臟修復的作用。本研究的目的是通過體外實驗，觀察MSC、

2、MV對受損腎臟細胞的修復作用。
　　方法:利用C57BL/6雄性6周齡小鼠通過全骨髓法分離培養(yǎng)擴增純化小鼠間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)至第三代的MSC(P3-MSC)采用流式細胞儀檢測細胞表面標記的表達(CD45、CD105)及成脂、成骨誘導分化的鑒定。MSC培養(yǎng)過程中收集MSC培養(yǎng)液，經(jīng)超速冰凍離心提取MV。體外培養(yǎng)近端腎小管上皮細胞系(HK-2)，以濃度為6ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Fact

3、or-β1，TGF-β1)刺激細胞24或48小時。實驗分組:(1)HK-2組，(2) HK-2+TGF-β1(6ng/ml)組，(3)HK-2+TGF-β1+MSCs(1×105 cells/200ul)組，(4) HK-2+TGF-β1+MVs(30μg/ml)組。收集細胞，進行形態(tài)學觀察，并收集細胞檢測平滑肌肌動蛋白-α(α-smooth muscleactina，α-SMA)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin) mRNA及其蛋白

4、的表達水平。
　　結(jié)果:各組細胞分別經(jīng)過48、72小時培養(yǎng)，光鏡下可見TFG-β1刺激后，細胞凋亡明顯增多，細胞間隙增大，細胞纖維化程度明顯，呈長梭形，且隨著時間的推移，損傷程度明顯增加; MSC、MV能夠在損傷條件下，減少HK-2細胞凋亡，減輕細胞纖維化程度，細胞間隙未見明顯增寬，細胞狀態(tài)較損傷組明顯得到改善。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1刺激后，E-cadherin基因及蛋白表達均減少，α-SMA表達增多，且72h表達量多于

5、48h;而MSC、MV組，α-SMA表達明顯減少，E-cadherin表達稍降低。
　　結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細胞能夠抑制由TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化損傷，并發(fā)揮一定的修復作用，而干細胞所提取的微泡能夠發(fā)揮與之相似的修復作用。
　　研究二骨髓間充質(zhì)干細胞來源的微泡對5/6腎大部切除小鼠腎臟的保護作用
　　目的: 已有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC，mesenchymal stem cell)可能通過旁分泌機

6、制，而不是由MSC直接作用于損傷部位的方式而減輕受損腎臟功能損傷。進一步研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞提取的微泡(MVs)可能通過細胞之間的通訊而發(fā)揮旁分泌機制而發(fā)揮相關的生物學功能。本研究的目的是研究MSC、MV在5/6腎大部切除(Subtotal nephrectomy, Nx)小鼠模型中的修復作用。
　　方法: 將實驗小鼠隨機分為4組:對照組，Nx組，Nx+ MSC組和Nx+ MV組。在腎大部切除手術后的第二天，Nx+ MS

7、Cs組和Nx+ MV組通過尾靜脈分別注射MSC（1×10∧6/小鼠）和MV（30μg/小鼠），之后隔日注射相同劑量。首次給藥后第7天處死小鼠，留取腎臟組織、血液標本，檢測血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿酸(uric acid，UA)和蛋白尿，以及腎臟的組織病理學分析。
　　結(jié)果: 與Nx組相比較，Nx+ MSC組和Nx+ MV組的血肌酐、尿酸和蛋白尿的水平顯著(p＜0.05)降低。損傷后注射MV和MSC的小鼠

8、殘余腎呈現(xiàn)較輕微的間質(zhì)纖維化及淋巴細胞浸潤，與未經(jīng)處理的Nx組相比，腎小管萎縮明顯減少。腎大部切除組小鼠的腎臟組織學評分是3.13±0.74，而MSC處理組為1.67±0.47，和MV注射組1.80±0.44，組織損傷程度明顯減輕(p＜0.01)。
　　結(jié)論:本研究顯示，MV能夠從功能、形態(tài)等方面保護受損腎臟，并且與MSCs在腎臟修復中的作用相似。結(jié)果表明，MV可能為慢性腎衰竭的治療提供新的途徑。
　　研究三骨髓間充質(zhì)干細胞

9、來源的微泡對單側(cè)輸尿管梗阻所致腎臟纖維化的修復作用及其micro-RNA修復機制的探討
　　目的:骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow stem cells，MSC)可通過旁分泌作用對受損腎臟發(fā)揮修復作用，干細胞來源的微泡(Micro-vesicles，MV)能夠傳遞多種生物活性物質(zhì)，在修復作用中發(fā)揮關鍵作用，但其修復機制尚未明了;本研究的目的是觀察MSC、MV在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructi

10、on，UUO)小鼠模型中的修復作用，并對其發(fā)揮作用的micro-RNA機制進行初步探索。
　　方法:常規(guī)方法提取骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)鑒定、培養(yǎng)、傳代，從MSC上在此過程中收集MSC培養(yǎng)液，經(jīng)超速冰凍離心提取MV。在體外實驗中，將實驗小鼠分為4組:對照組，單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)組，MSC治療組(UUO+MSC)，和MV治療組(UUO+MV)。手術后根據(jù)分組分別注射MSC和MV。手術后7或14天處死小鼠，留取標本作進一步生化、病理等

11、檢測。此外，利用miRCURYTMHy3TM/Hy5TM Power labeling kit and hybridized on the miRCURYTM LNA Array基因芯片技術檢測MSC和MV中所攜帶的micro-RNA，并進行篩選分析。
　　結(jié)果:MV和MSC注射組小鼠血尿素氮水平較單側(cè)輸尿管梗阻組顯著降低（p＜0.01,11.3±0.5 vs.9.8±0.7 mmol/L,p＜0.01,12.3±1.6 vs.8

12、.7±1.5 mmol/L）。第7天結(jié)果顯示，MV治療組血肌酐水平較UUO手術組降低明顯(p＜0.05，107.1±10.1vs.57.0±10.8 mmol/L)。在第14天，MSC和MV注射組的血肌酐水平較UUO組明顯降低:p＜0.05，112.1±28.9 vs.75.4±17.7mmol/L，112.1±28.9 vs.64.2±9.8mmol/L。MV注射組血尿酸水平在第7天、第14天均出現(xiàn)明顯降低:p＜0.01，227.7±

13、63.7 vs.80.9±26.5 mmol/L;237.0±16.1 vs.78.0±18.9 mmol/L。此外，MSC/MV鎖核酸micro-RNA芯片表達譜結(jié)果分析顯示，共檢測到503種mi-RNA有熒光信號的表達，其中MSC中266種，MV中237種，與纖維化相關的micro-RNA包括miR29，30，200家族等。
　　結(jié)論:MV、MSC能夠?qū)κ軗p的纖維化腎臟發(fā)揮一定的修復作用，從而保護受損腎臟。MV中所包含的某類特