篩選膀胱癌尿液新標記物Gc-globulin的熒光差異蛋白質組學研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率不斷上升。世界范圍內，膀胱癌位列男性最常見實體瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新診斷的膀胱癌患者超過350，000名。美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計2010年美國膀胱癌新發(fā)病例為70，530例，死亡病例為14，680例。在我國，膀胱癌目前仍是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢。臨床特點為一旦腫瘤侵襲漿膜層則復發(fā)率高、預后差。膀胱癌患者中超過90％為尿路上皮癌，首次確

2、診為膀胱癌的患者中，55％～60％為低級別尿路上皮癌。低級別尿路上皮癌即使經過適當?shù)那粌然蜷_放治療，仍有很高的復發(fā)率。通常，復發(fā)仍為分化較好的低級別尿路上皮癌，但仍有16％～25％的患者腫瘤病理分級增加，且大約10％低級別尿路上皮癌可發(fā)展為肌層浸潤或遠處轉移。膀胱低級別尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因及多途徑改變的復雜過程。
　　 在目前臨床工作中，膀胱鏡檢查是發(fā)現(xiàn)，診斷及監(jiān)測膀胱癌復發(fā)和進展的金標準。反復的膀胱鏡檢查在疾

3、病早期階段促使患者接受有效的治療，因此潛在地減緩了疾病向肌層侵襲的進展。然而，膀胱鏡是一種侵襲性、費時和昂貴的檢查手段，不能夠很好地被患者接受和配合。尿脫落細胞學檢查仍是輔助膀胱鏡的一種非侵襲性的檢查手段，特別是在發(fā)現(xiàn)高侵襲性膀胱癌方面具有很高的敏感度，但在低度惡性的病變方面其敏感度較低，并且它的準確性依賴于病理醫(yī)師的經驗。因此，在篩查、早期發(fā)現(xiàn)和預測淺表腫瘤向侵襲性進展方面，致力于尋找具有高敏感度和特異度、可信賴的非侵襲性標記物具有重

4、要的臨床意義。迄今為止，臨床常規(guī)流程中，仍沒有敏感度和特異度高的血清或尿液腫瘤診斷標志物用以發(fā)現(xiàn)及跟蹤隨訪膀胱癌患者。
　　 雖然基于基因水平的基礎研究可以為膀胱癌疾病的發(fā)生，發(fā)展分子機制的解讀提供有力的依據(jù)，但是這些研究往往強調單個或者少數(shù)幾個分子的作用，缺乏蛋白質水平的整體性、整合性及系統(tǒng)性的研究。歸根結底，蛋白質是生命活動的直接執(zhí)行者，且某些基因的表達產物可能不只一個，而且基因的表達方式錯綜復雜，同樣的一個基因在不同的機體

5、周圍環(huán)境和不同的機體生理狀態(tài)下，會產生不同的蛋白質，發(fā)揮完全不同的作用。基因結構和功能的穩(wěn)定性與蛋白質的復雜性和多變性存在巨大的反差。此外，對于功能蛋白質，還涉及到蛋白質的后期加工、修飾以及轉運定位的過程，這些過程是基因不能決定的;但這些過程中的任何一個步驟發(fā)生微細的差錯即可導致機體的疾病。另外，miRNA的發(fā)現(xiàn)也使我們意識到即使是在mRNA上表達有差異，但由于miRNA對轉錄后的基因表達調控，也有可能在相應的蛋白質水平上表達有差異。因

6、此，膀胱癌疾病蛋白水平的研究是不容忽視的重要課題。
　　 蛋白質組是一個在時間和空間上動態(tài)變化著的整體，其目的是從整體的角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白組成成分，表達水平與修飾狀態(tài)，以及蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。研究體液的蛋白質組學模式的出現(xiàn)在早期發(fā)現(xiàn)癌癥方面尋找新的、高敏感度的診斷工具提供新的機會。臨床蛋白質組學領域的主要目的是在體液中尋找能夠鑒別疾病的標志物，可以相對廉價的檢測并早期診斷疾病。

7、目前而言，血清或血漿蛋白質組學受到廣泛關注。由于尿液可直接接觸腫瘤并且樣本易于獲取，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)及疾病監(jiān)測方面，尿液相對于用血漿來發(fā)現(xiàn)膀胱癌潛在的標志物而言是一個有吸引力的選擇。盡管現(xiàn)在一些同時存在于血液和尿液中的蛋白已經被作為膀胱癌的標記物，如膀胱癌抗原、核基質蛋白和纖維蛋白原代謝產物;但是其特異性和敏感性都欠理想。運用蛋白組學技術從尿液樣本中來研究膀胱癌尿液相關蛋白以篩選，診斷及監(jiān)測預后是目前研究重要的趨勢。
　　 目前

8、為止，已有不少研究運用雙向凝膠電泳和質譜鑒定技術以識別在膀胱癌尿液中差異表達的蛋白，并且應用考馬斯染色、銀染或放射標記染色法標記尿蛋白提取物。如2009年Feldman.etal運用蛋白質組學策略分析了膀胱癌患者和正常對照人群的尿液差異蛋白，并對興趣蛋白Cystatin B進一步在組織中應用免疫組織化學技術和在尿液中用半定量的Western blot技術進行分析。研究結果發(fā)現(xiàn)尿液中Cystatin B的表達水平與腫瘤的分級(P=0.06

9、2)，分期(P=0.0047)及腫瘤復發(fā)(P=0.0104)和進展(P=0.0007)的時間正相關。2011年Li.etal[8]通過運用雙向電泳篩選健康志愿者和低度惡性及侵襲性膀胱癌患者的尿液樣本，以期識別能夠早期檢測膀胱癌的生物標記物。他們觀察到纖維蛋白原、乳酸脫氫酶B、載脂蛋白A1、叢生蛋白和觸珠蛋白等5個蛋白在低度惡性或侵襲性膀胱癌患者尿液中表達增高。進一步對尿液樣本分析后發(fā)現(xiàn)，相對于低度惡性膀胱癌，載脂蛋白A1在侵襲性膀胱癌中

10、表達顯著增高。應用ELISA法測定載脂蛋白A1的水平，發(fā)現(xiàn)在18.22ng/ml水平其具有可以從正常人群中辨別膀胱癌患者的診斷效能（敏感度和特異度分別為91.6％和85.7％），并認為其濃度在29.86ng/ml水平可辨別侵襲性膀胱癌患者和低度惡性膀胱癌患者（敏感度和特異度分別為83.7％和89.7％）。
　　 然而，隨著蛋白質組學技術的改進，熒光差異雙向凝膠電泳技術為基礎的蛋白質組學研究是研究的趨勢。熒光差異凝膠電泳技術可在同

11、一塊膠上同時分離多個分別由不同熒光標記的樣品。由于不同的熒光標記樣品有不同的激發(fā)波長，可通過不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結果。由于有了多色熒光標記，使得在同一塊膠中分離并分析多個樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統(tǒng)誤差，特別適合比較不同樣本間差異。1997年，Unlu等發(fā)表了第一篇熒光差異凝膠電泳的論文，將不同的樣品分別用不同的熒光染料進行標記后混合在同一塊凝膠中進行雙向電泳，極大地提高了實驗結果的重復性和定量的準確性。據(jù)我們所

12、知，應用熒光標記尿蛋白提取物進行雙向凝膠電泳的技術報道比較罕見。僅Orenes-Pinero等通過研究發(fā)現(xiàn)可以運用熒光差異雙向凝膠電泳蛋白組學策略來探索診斷膀胱癌的尿液標記物。
　　 本研究正式立足于尿液蛋白質組學水平，建立規(guī)范和標準的收集臨床標本工作流程，制定科學合理的納入和排除標準，在收集足夠膀胱癌患者和健康對照人群尿液樣本的基礎上，按照病理診斷結果進行分組（低級別尿路上皮癌組，高級別尿路上皮癌組和浸潤性尿路上皮癌組），利用

13、反復超濾和除鹽份的方法濃縮，純化尿液蛋白，利用熒光差異雙向凝膠電泳進行篩選及分離，電泳后用Typhoon9400成像系統(tǒng)掃描凝膠并用DeCyder軟件分析差異蛋白。運用基質輔助激光解吸電離飛行時間技術對這些差異蛋白進行鑒定，聯(lián)合生物信息學方法以選取感興趣的候選蛋白(Gc-globulin)。待對候選蛋白驗證其結果可靠性后，對大量臨床膀胱癌患者尿液和對照組尿液樣本進行ELISA定量檢測GC的濃度，結合已檢測臨床標本的臨床資料進行統(tǒng)計分析以

14、建立候選蛋白分子標記物GC與膀胱癌疾病的聯(lián)系，進一步確定有效診斷和監(jiān)測膀胱癌疾病的蛋白分子標記物，對于研究膀胱癌的發(fā)病機制，診斷方法，疾病監(jiān)測和治療方法等方面的研究奠定基礎。
　　 目前運用熒光差異雙向凝膠電泳的蛋白組學技術研究膀胱癌尿液蛋白的文獻報道比較少，為此開展篩選膀胱癌尿液新標記物Gc-globulin的熒光差異蛋白質組學研究正是立足于從尿液蛋白水平獲取理想的膀胱癌診斷，進展及預后分子標記物，闡述相關的發(fā)病機制。無疑對深

15、入了解膀胱癌疾病的發(fā)生，發(fā)展及預后問題，是具有重要的理論及現(xiàn)實意義的研究項目。
　　 研究方法
　　 （一）臨床資料和標本收集
　　 (1)膀胱癌組尿液標本來自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院泌尿外科住院患者。所有膀胱癌的患者經術前CT或逆行腎盂輸尿管造影來確定上尿路沒有病變。這些患者都有最初診斷的陽性結果或者膀胱鏡檢查指證。膀胱鏡檢查前收集患者尿標本。正常對照組尿液標本來南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院體檢中心健康人群。尿液標本收集后

16、立即冷卻到4℃，然后在4個小時內轉移到-80℃儲存。詳細登記好病人的臨床資料特別是膀胱鏡檢查組織病理結果，術后病理結果及臨床診斷結果?；颊咦栽妇璜I并簽定知情同意書。本研究經南方醫(yī)院倫理道德委員會批準。排除標準:1:伴有腎臟疾病尿蛋白陽性的患者;2:伴有除膀胱癌外其他泌尿系腫瘤的患者;3:伴有不明原因的肉眼血尿的患者（電泳時）;4:伴有嚴重的泌尿系感染的患者（電泳時）。
　　 （二）候選蛋白標記物的篩選(1)選取正常對照組和膀胱癌

17、組尿液標本各12例，其中低級別尿路上皮癌，高級別尿路上皮癌和浸潤性尿路上皮癌樣本各4例。將樣本從-80℃冰箱拿出，融解后即刻添加蛋白酶抑制劑(50:1)，采用反復超濾離心洗滌的方法聯(lián)合除鹽方法濃縮，純化尿液蛋白。用Bradford方法進行蛋白濃度測定。
　　 (2)運用雙向凝膠電泳構建穩(wěn)定性好，重復性高的人尿液雙向電泳圖譜
　　 (2.1)蛋白樣品和上樣緩沖液共450μL充分混合，用24 cm IPG干膠條采取被動泡漲1

18、3h，等電聚焦條件為500 V1h，1，000 V1h，5，000 V1h，8，000 V60KVh，500 V3h。聚焦完畢后將膠條先后平衡兩次，隨后將膠條移至12.0％的SDS-PAGE膠上端進行第二向電泳，直至溴酚藍達膠底線。
　　 (2.2)銀染40.0％乙醇，10.0％冰醋酸固定2次，每次15 min;30.0％乙醇，0.2％Na2S2O3，6.8％乙酸鈉敏化30min;蒸餾水洗3次，每次5 min;2.50‰AgNO

19、3染色20min;蒸餾水洗2次，每次1min;2.5％Na2CO3，0.04‰甲醛顯影至蛋白質點清晰;立即加入5.0％冰醋酸終止10 min;蒸餾水洗3次，每次5min;最后用30.0％乙醇，4.6％甘油保存。
　　 (2.3)凝膠通過UMAX PowerLook1100投射掃描儀進行掃描獲取2-DE凝膠圖像，利用Melanie4分析軟件對圖像進行分析。
　　 (3)運用熒光差異雙向凝膠電泳技術對正常對照組和膀胱癌組尿液

20、蛋白進行分離及篩選差異蛋白
　　 (3.1)將正常對照組和膀胱癌組尿液組各組樣品pH值調至8.5;每份樣本50μg(5～10μl)避光條件下加入1μl(400 pmol)的CyDye Cy3、Cy5、Cy2熒光染料工作液，其中Cy2作為內標標記兩組尿液蛋白樣品混合物，Cy3標記健康對照組尿液蛋白樣品，Cy5標記膀胱癌組尿液蛋白樣品。
　　 (3.2)將標記熒光染料的樣品進行雙向電泳，步驟與普通雙向電泳相同。
　　

21、 (3.3)直到溴酚藍到達膠的底端結束雙向電泳。用Typhoon9400成像系統(tǒng)掃描熒光凝膠，各熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為:Cy2:480nm和530nm，Cy3:540nm和590nm，Cy5:620 nm和680 nm。掃描后的圖像文件用DeCyder5.0版本軟件分析，應用BVA模式進行膠與膠之間的匹配，不同組間選擇Student-t檢驗。挑選出兩組間具有統(tǒng)計學意義且差異倍數(shù)＞2.0的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點

22、。
　　 (3.4)取對照組及實驗組蛋白樣品各500μg，按常規(guī)方法進行制備膠雙向電泳后，經考馬斯亮藍染色，用機械手臂挖取與感興趣差異蛋白相匹配的蛋白點。對所挖取蛋白點用50％乙腈沖洗、胰蛋白酶消化、并在靶條上進行標肽和蛋白樣品點樣后，應用基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜分析蛋白質肽質量指紋譜，并將結果輸入NCBI和SWISS-PROT蛋白質數(shù)據(jù)庫進行檢索。
　　 （三）應用生物信息學方法選定候選蛋白GC借助生物信息學

23、研究手段如:SWISS-PROT，String和Pubgene等工具對所鑒定蛋白分析所參與的生物學過程、蛋白質間的相互作用及蛋白質特有的結構和功能等，以便選取候選蛋白進行進一步研究。
　　 （四）候選蛋白GC在健康人群和膀胱癌患者尿液中的表達
　　 (1)候選蛋白的Western Blot驗證:選取正常對照組尿液標本8例;膀胱癌組尿液標本8例，其中低級別尿路上皮癌2例，高級別尿路上皮癌2例和浸潤性尿路上皮癌4例。每個樣本

24、各自提取尿液總蛋白定量后，每孔加入約30μg蛋白，10％SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1h，封閉一抗、二抗后由ECL化學發(fā)光試劑盒檢測，壓底片曝光后顯影。
　　 (2)選取144例尿液樣本運用ELISA方法檢測GC濃度，其中正常對照組42例;膀胱良性病變11例和膀胱癌組91例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織膀胱癌的分類標準:浸潤性尿路上皮癌23例和非浸潤性尿路上皮癌68例（低級別尿路上皮癌3

25、8例，高級別尿路上皮癌30例）。
　　 （五）候選蛋白GC濃度與相關臨床資料的統(tǒng)計分析待健康人群和膀胱癌患者中候選蛋白濃度定量檢測后，根據(jù)臨床資料如:年齡，性別，腫瘤的原發(fā)/復發(fā)，轉移/未轉移，伴/不伴血尿，病理分級等進行亞組分析;還有通過ROC曲線來確定用于診斷膀胱癌/區(qū)分浸潤性膀胱癌的cut-off值，并計算相應的特異度和敏感度。
　　 （六）候選蛋白GC在正常對照和膀胱癌組織中的表達
　　 (1)差異表達蛋

26、白的Western Blot驗證:對單個的正常對照組和膀胱癌組織樣本運用液氮研磨的方法提取總蛋白進行免疫印跡檢測。
　　 (2)差異表達蛋白的免疫組織化學技術驗證:選取正常對照組標本10例;膀胱癌標本26例的石蠟包塊進行研究。其中低級別尿路上皮癌8例，高級別尿路上皮癌8例和浸潤性尿路上皮癌10例。石蠟切片常規(guī)脫臘入水，接著用3％H202-甲醇10分鐘后，水洗，再用PBS洗3次后，加生物素標記的特異性一抗，37℃30分鐘，置濕盒內

27、。PBS洗3次，加酶標記的卵白素，37℃30分鐘，PBS洗3次，DAB顯色后，流水沖洗，復染、脫水、封片。
　　 研究結果：
　　 1.對收集的人尿液樣品進行反復超濾及除鹽優(yōu)化處理后，可成功地獲得人尿液樣本分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜;
　　 2.成功構建了膀胱癌組和正常對照組尿液樣本的2D-DIGE圖譜，對其中24個差異超過2倍的差異點進行質譜鑒定，共鑒定出16個不同的蛋白。其中ALB，GC，HP，F(xiàn)GB，

28、APOA1，RBP4和SECTM1等7個蛋白在膀胱癌組中的尿液樣品中高表達，剩余UMOD，KNG1，AMY1A，AMY2A，ITIH4，AMBP， HSPG2，CST5和MASP2等9個蛋白在膀胱癌組中低表達;
　　 3.String和Pubgene等生物信息學分析提示GC蛋白在生長，發(fā)病機理，分泌，翻譯，細胞凋亡，死亡，消化及信號轉導等生物過程起著重要的作用，且GC蛋白與其他已鑒定的差異蛋白有著密切的聯(lián)系，可作為候選蛋白;

29、r>　　 4.GC蛋白的Westem blotting結果比較發(fā)現(xiàn)GC在膀胱癌組尿液樣品中的表達水平要高于正常對照組，有顯著性差異。Western blotting結果與蛋白質組學的結果一致。
　　 5.膀胱癌組織中的GC蛋白的表達要高于癌旁組織的表達。通過兩組的免疫組織化學結果也發(fā)現(xiàn):GC在移行上皮細胞和腫瘤細胞的胞漿中表達，染色較正常對照組強。提示GC在膀胱癌組中表達上調;
　　 6.膀胱癌組GC蛋白濃度為1013

30、.70±851.25 ng/mg，良性病變組GC蛋白濃度為105.32±47.81ng/mg，正常對照組GC蛋白濃度為99.34±55.87 ng/mg。膀胱組與良性病變組和正常對照組均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但良性病變組和正常對照組之間沒有統(tǒng)計學差異。按照病理級別分組，低級別尿路上皮癌GC蛋白濃度為472.92±348.02 ng/mg，高級別尿路上皮癌GC蛋白濃度為1014.06±753.16 ng/mg，浸潤性尿路上皮癌GC

31、蛋白濃度為1906.69±840.86ng/mg;且三組間均有統(tǒng)計學差異。
　　 7.ROC分析示采用161.086 ng/mgGC蛋白濃度來篩選膀胱癌，相應的敏感度和特異度為92.31％和83.02％;當尿液中GC蛋白濃度大于1407.481 ng/mg時，提示為浸潤性膀胱癌，其敏感度和特異度為82.61％和88.24％。
　　 結論
　　 1.建立了穩(wěn)定性高，重復性較好的人尿液蛋白組雙向凝膠電泳技術和方法，為

32、人膀胱癌尿液蛋白質組學進一步研究奠定了基礎;
　　 2.運用熒光差異蛋白組學方法比較了膀胱癌組和正常對照組尿液樣本蛋白圖譜;
　　 3.對24個差異蛋白點進行質譜鑒定，共鑒定出16個不同的蛋白。其中ALB，GC，HP，F(xiàn)GB，APOA1，RBP4和SECTM1等7個蛋白在膀胱癌組中的尿液樣品中高表達，剩余UMOD，KNG1，AMY1A，AMY2A，ITIH4，AMBP， HSPG2，CST5和MASP2等9個蛋白在膀胱癌