JSRV-NM株env基因和CA基因的克隆、表達及其單抗的制備.pdf

1、綿羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis，SPA)是由β-反轉(zhuǎn)錄病毒屬，綿羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的一種肺腫瘤性疾病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病。 為了進一步研究JSRV的致病機制及建立快速診斷SPA的方法，本研究對內(nèi)蒙古某市種羊場綿羊肺腺瘤病進行流行病理學研究的基礎上，從綿羊肺腺瘤病病毒內(nèi)蒙株(JSRV-NM)自然感染羊的肺腫瘤

2、組織中提取基因組DNA，根據(jù)JSRV-NM株基因組全序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，在env基因的表面蛋白(SU)及跨膜蛋白(TM)基因和gag基因的衣殼蛋白(CA)基因設計引物，經(jīng)體外重組技術分別進行克隆、構建重組質(zhì)粒并測序分析變異情況，再分別亞克隆至原核表達載體，在大腸桿桿菌系統(tǒng)中表達蛋白；將CA基因C末端融入HA序列，再亞克隆至真核表達載體上，在真核細胞中進行表達。以原核表達CA蛋白的純化產(chǎn)物免疫BAL

3、B/c小鼠，制備其單克隆抗體(McAb)，以原核表達產(chǎn)物與真核表達產(chǎn)物篩選、鑒定制備的McAb。同時，對SPA自然病例和人工感染病例，用所建立的實時熒光定量PCR(real-time Q-PCR)方法檢測其外周血白細胞、肺臟、肺門淋巴結(jié)及鼻液中JSRV-NM株前病毒拷貝數(shù)。實驗結(jié)果表明： (1)構建的重組質(zhì)粒pGEM-T-CA、pGEM-T-SU和pGEM-T-TM，分別經(jīng)測序分析結(jié)果顯示，CA基因與JSRV-NM株比較氨基酸序列同源性

4、可達99.45％；SU基因所編碼的氨基酸共有8處發(fā)生突變，同源性為97.36％；TM基因核苷酸序列發(fā)生很多突變和終止密碼子，與JSRV-NM株序列中該段序列同源性僅為80.2％，這些缺陷型前病毒的大量存在可能與免疫保護存在一定的關系，有待進一步研究；與內(nèi)源性enJSRV的TM部分序列進行比較結(jié)果顯示，其氨基酸序列中具有外源性exJSRV特有的致病性“YXXM”序列。(2)重組原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-CA和pGEX-4T-1-SU

5、及pGEX-4T-1-TM可以在大腸桿菌中分別以可溶性和包涵體形式高效表達，表達的CA、SU和TM融合蛋白表觀分子量分別約為37KD<,a>、68KD<,a>和46KD<,a>，表達量分別占全菌蛋白的20％、25％和30％，并利用谷胱甘肽Sepharose 4B親和層析柱純化可溶性表達蛋白和從包涵體分離純化得到的表達蛋白具有較高純度，是一種理想的免疫原。(3)構建的重組真核表達載體pCDNA3.1(+)-CA-HA，轉(zhuǎn)染至293細胞和H

6、ela細胞后，用Anti-HA單抗經(jīng)間接免疫熒光和Westhem blotting法檢測蛋白表達。結(jié)果顯示該載體轉(zhuǎn)染293細胞后，可在細胞內(nèi)觀察到特異性熒光和檢測到目的基因的表達產(chǎn)物。說明已成功地構建了CA蛋白的真核表達載體，并可在真核細胞內(nèi)表達CA目的基因。(4)用原核表達CA蛋白的純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞。利用CA真核表達蛋白分別對此3株雜交

7、瘤細胞經(jīng)間接免疫熒光方法鑒定，結(jié)果證實所獲得的3株雜交瘤細胞分泌的抗體均為針對JSRV-NM株CA蛋白的特異性McAb。(5)根據(jù)JSRV-NM株env基因序列，選取其保守序列作為檢測的目的片段，設計并合成相應的引物和TaqMan探針，以SPA自然病例的肺腫瘤組織基因組DNA為模板，用PCR方法構建重組質(zhì)粒pGEM-T-Env，并嚴格定量后，梯度稀釋作為陽性標準品，優(yōu)化反應條件后進行real-time Q-PCR擴增，獲得相應的標準曲線

8、為：Y=-3.308X+47.848，線性相關系數(shù)為0.991；經(jīng)同一標本重復檢測，C<'t>值變異系數(shù)小，并且靈敏度比常規(guī)PCR高10-100倍。因此初步建立了檢測JSRV前病毒DNA的real-time Q-PCR技術平臺。(6)應用初步建立的real-time Q-PCR方法對不同來源的綿羊外周血樣品及其他組織樣品進行初步地檢測，測定其前病毒載量。結(jié)果顯示B組和C組外周血白細胞、肺臟、肺門淋巴結(jié)以及鼻液中檢測前病毒DNA均為陽性，

9、并發(fā)現(xiàn)前病毒DNA的載量在肺臟中明顯高于外周血白細胞，高達10～1000個拷貝：D組雖未發(fā)現(xiàn)有SPA臨床癥狀，但在肺門淋巴結(jié)里可以檢測到前病毒DNA；E組中一只綿羊的肺臟也檢出低拷貝數(shù)的前病毒DNA，而在A組中檢測結(jié)果均為陰性。 本研究是國內(nèi)首次對JSRV進行相關蛋白的分子克隆與表達研究、單克隆抗體的制備以及real-time Q-PCR檢測，對SPA分子發(fā)病機理進一步研究及建立更為靈敏的檢測JSRV的特異性方法以及研究SPA防