HSF1對內(nèi)毒素血癥小鼠多器官損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)。雖然膿毒癥的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但是革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁上的脂多糖(lipopolysacchride，LPS)即內(nèi)毒素啟動體內(nèi)免疫系統(tǒng)在膿毒癥發(fā)病中的重要性已受到廣泛關(guān)注。LPS進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動宿主防御反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)基因的過度表達(dá)和全身炎癥細(xì)胞活化。膿毒癥發(fā)生機(jī)

2、制的核心是感染所引起的失控性炎癥反應(yīng)，其主要特征和機(jī)制是過度的中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)浸潤，引起多器官損傷。
　　熱休克因子1(heat shock factor1，HSF1)是調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本室前期研究發(fā)現(xiàn)HSF1敲除小鼠(HSF1-/-)對LPS的敏感性顯著增強(qiáng)和生存率明顯降低，表明HSF1對LPS所致的內(nèi)毒素血癥具有保護(hù)作用。但是HSF1的保護(hù)機(jī)制目前仍不

3、清楚。內(nèi)毒素血癥的主要特征和機(jī)制是大量中性粒細(xì)胞浸潤肺、肝和腎等。HSF1是否影響LPS所致內(nèi)毒素血癥的中性粒細(xì)胞浸潤？目前尚未見報道。
　　為了探討HSF1對LPS所致的內(nèi)毒素血癥小鼠的多器官損傷的保護(hù)作用和可能機(jī)制，本研究第一章采用復(fù)制內(nèi)毒素血癥小鼠模型，在整體水平進(jìn)行一系列組織細(xì)胞損傷指標(biāo)測定和組織學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型(wild type，WT)小鼠相比較，LPS注射4h引起HSF1-/-小鼠釋放到血清的炎性介質(zhì)（IL-

4、6和G-CSF）和器官損傷酶學(xué)指標(biāo)(LDH、BUN和ALT)水平明顯升高，肺和腎微血管通透性和濕干比重顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LPS注射導(dǎo)致HSF1-/-小鼠肺、肝和腎等易感器官的中性粒細(xì)胞浸潤明顯增多，組織損傷更加明顯，與LPS引起HSF1-/-小鼠的生存率顯著降低相一致。上述結(jié)果表明HSF1對LPS誘導(dǎo)的多器官損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制過度的中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)。
　　中性粒細(xì)胞浸潤是涉及粘附和趨化作用的、受到精細(xì)調(diào)節(jié)的一個

5、多步驟過程。最近，本室利用HSF1-/-和WT小鼠制備內(nèi)毒素血癥模型，采用含384個炎癥因子基因的微陣列從內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織中篩選HSF1調(diào)控的炎癥相關(guān)基因，首次發(fā)現(xiàn)HSF1可能抑制與細(xì)胞的粘附和趨化有關(guān)的兩個分子的表達(dá):即細(xì)胞粘附分子P選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand1，PSGL-1)和趨化因子受體XCR1。這提示HSF1對LPS所致內(nèi)毒素血癥的中性粒細(xì)胞的粘附和趨化作用可能存在抑制作用

6、。
　　為了探討HSF1對LPS所致的內(nèi)毒素血癥的中性粒細(xì)胞粘附作用的影響及其機(jī)制，本研究第二章采用HSF1-/-小鼠復(fù)制內(nèi)毒素血癥小鼠模型，運(yùn)用抗粒細(xì)胞染色法在整體水平觀察中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)HSF1-/-小鼠中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附比WT小鼠中性粒細(xì)胞更強(qiáng)。進(jìn)一步采用實時定量PCR檢測骨髓中性粒細(xì)胞的PSGL-1 mRNA水平，采用細(xì)胞流式術(shù)檢測用或不用抗PSGL-1單抗處理的內(nèi)毒素血癥小鼠

7、的循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的PSGL-1的蛋白表達(dá)水平，采用細(xì)胞流式術(shù)和免疫組化技術(shù)分別檢測循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的CD11b和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)水平，中性粒細(xì)胞表面的PSGL-1和CD11b表達(dá)水平比較低，而在HSF1-/-小鼠中性粒細(xì)胞的表達(dá)比WT更高。經(jīng)LPS刺激后，中性粒細(xì)胞表達(dá)PSGL-1和CD11b上調(diào)，與WT組比，LPS誘導(dǎo)HSF1-/-中性粒細(xì)胞表面的PSGL-1和CD11b表達(dá)上調(diào)更顯著。P

8、SGL-1的蛋白表達(dá)變化與mRNA水平的變化十分相似。這表明HSF1可下調(diào)中性粒細(xì)胞表面的PSGL-1和CD11b的組成型表達(dá)與LPS所致的誘導(dǎo)型表達(dá)。另外，LPS誘導(dǎo)HSF1-/-小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)更高的ICAM-1水平。而LPS處理對WT和HSF1-/-中性粒細(xì)胞的Hsp70表達(dá)沒有顯著影響。這些結(jié)果表明在內(nèi)毒素血癥過程中，HSF1通過抑制中性粒細(xì)胞表面的PSGL-1和CD11b的上調(diào)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1表達(dá)，

9、從而抑制LPS所致的中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
　　趨化性是吞噬細(xì)胞朝一些濃度遞增的趨化物如細(xì)菌因子(LPS等)和趨化因子進(jìn)行定向運(yùn)動的特性。為了探討HSF1對中性粒細(xì)胞趨化作用的影響及其機(jī)制，本研究第三章利用WT和HSF1-/-小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，采用趨化實驗在細(xì)胞水平觀察兩種不同基因型細(xì)胞對LPS或肺勻漿的趨化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)HSF1-/-小鼠骨髓中性粒細(xì)胞對LPS或內(nèi)毒素血癥小鼠肺勻漿的趨化性比WT小鼠中性粒細(xì)胞明顯增強(qiáng)。然后復(fù)

10、制內(nèi)毒素血癥模型，在整體水平采用ELISA檢測血清趨化因子MIP2和XCL1的水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的CXCR2的表達(dá)水平，采用實時定量PCR和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分別檢測中性粒細(xì)胞的XCR1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)WT和HSF1-/-小鼠循環(huán)中性粒細(xì)胞的CXCR2表達(dá)降低，在LPS注射的WT和HSF1-/-小鼠之間，兩組循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的CXCR2表達(dá)無明顯差異。盡管經(jīng)LPS注射后，WT和HSF1-/

11、-小鼠血清MIP2水平都顯著升高，但在WT和HSF1-/-之間沒有明顯的差異。然而，內(nèi)毒素血癥時，HSF1-/-小鼠循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的XCR1表達(dá)水平和釋放到血清的XCL1水平均明顯高于WT小鼠。在體外，LPS誘導(dǎo)HSF1-/-小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的XCR1 mRNA和蛋白水平顯著增加。且隨LPS處理時間的延長，HSF1-/-骨髓中性粒細(xì)胞表達(dá)的XCR1蛋白遞增，而LPS對WT骨髓中性粒細(xì)胞的XCR1表達(dá)沒有明顯的影響。值得注意的是，在

12、基礎(chǔ)水平，HSF1-/-中性粒細(xì)胞的XCR1表達(dá)顯著低于WT中性粒細(xì)胞。其機(jī)制目前仍不清楚。上述結(jié)果表明HSF1對LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞表面的XCR1表達(dá)上調(diào)具有抑制作用。肌動蛋白細(xì)胞骨架和偽足小體形成的變化是遷移細(xì)胞的特點。為了明確HSF1-/-是否改變細(xì)胞骨架重排，我們研究了WT和HSF1-/-小鼠的循環(huán)中性粒細(xì)胞和骨髓中性粒細(xì)胞的F-actin重組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞形成富含F(xiàn)-actin的板狀偽足。與WT小鼠相

13、比，HSF1-/-小鼠骨髓中性粒細(xì)胞中顯示富含F(xiàn)-actin的范圍顯著增加，這與HSF1-/-中性粒細(xì)胞的趨化性和遷移增強(qiáng)一致。此外，HSF1-/-骨髓中性粒細(xì)胞的F-actin聚合隨體外LPS處理時間的延長而遞增。而一旦用actin聚合的抑制劑即細(xì)胞松弛素B破壞F-actin，則WT和HSF1-/-小鼠中性粒細(xì)胞對LPS的趨化反應(yīng)被完全廢除。這些結(jié)果表明在內(nèi)毒素血癥過程中，HSF1通過抑制中性粒細(xì)胞表面的XCR1表達(dá)上調(diào)和血清趨化因子

14、XCL1的產(chǎn)生，以及抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的F-actin聚合，從而抑制中性粒細(xì)胞的趨化和遷移。
　　此外，在前期工作中我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PSGL-1和XCR1基因的啟動子區(qū)上游均含有一個熱休克元件，因此HSF1可能在轉(zhuǎn)錄水平直接抑制psgl-1和xcr1基因的表達(dá)。
　　綜上所述，本研究首次提出在小鼠內(nèi)毒素血癥過程中，HSF1對LPS誘導(dǎo)的多器官損傷的保護(hù)作用與抑制過度的中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)。一方面，HSF1通過