小分子RNA干擾Cx37對動脈粥樣斑塊的影響.pdf

1、目前，冠心病成為全球范圍內影響人類壽命的重大問題，國內外專家對冠心病的關注程度日益增加。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病發(fā)生的病理基礎，也是一種復雜的多因素疾病。有研究表明，遺傳因素貫穿于動脈粥樣硬化的始終?；虻淖兓赡茉贏S斑塊的進展和/或失穩(wěn)中起重要作用。遺傳流行病學研究也顯示遺傳因素在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展中有重要意義。近年來隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，從基因方面闡明冠狀動脈粥樣硬化性

2、心臟病的發(fā)生將為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診治開辟一個新領域。既往我們的調查表明間隙性連接蛋白37(Connexin37) C1019T基因多態(tài)性與冠心病有顯著相關性，而且在男性人群中更為明顯，同時在其他部位動脈粥樣硬化性疾病的研究中也提示存在相關性。但是，究竟是C等位基因還是T等位基因與冠心病相關目前有不同見解，這可能與樣本量含量大小、區(qū)域差異、臨床事件觀察終點的選擇（冠心病還是心肌梗死）等相關，Connexin37基因多態(tài)性與冠心病

3、的確切關系還有待大規(guī)模的病例對照研究、前瞻性研究加以證實。在發(fā)病機制方面，目前已明確的是:在早期動脈粥樣硬化斑塊形成階段，Connexin37基因多態(tài)性主要通過調節(jié)單核細胞黏附性來促進斑塊形成，但在斑塊進展期及斑塊破裂繼發(fā)血栓形成階段，Connexin37基因多態(tài)性具體分子作用還有待進一步闡明。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術又稱基因沉默技術，能有效高選擇性地阻斷目的基因的表達，近期已經(jīng)廣泛地應用

4、于體內和體外基因功能的研究中。哺乳動物細胞實驗顯示，化學合成的核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，或是質粒或病毒載體介導的siRNA，均可促發(fā)基因沉默或者表達抑制?；虺聊夹g在細胞水平致病基因的功能研究中已廣泛應用。借助于質?；虿《据d體的介導，siRNA已經(jīng)被用于在體實驗，高效降低靶基因的表達。在進一步完善siRNA穩(wěn)定性的基礎上，RNAi的試劑有望應用于臨床研究。
　　

5、目前國內外對于Cx37基因在AS中的作用的研究才剛開始，Cx37基因在AS發(fā)展中可能具有重要的調控作用，我們設想應用基因沉默技術干擾高脂飲食豬腹主動脈動脈斑塊Cx37表達，可能有助于阻止AS進程，綜上所述，本研究分為三部分:
　　第一部分研究目的:構建攜帶Cx37 siRNA慢病毒表達載體:根據(jù)Cx37基因設計siRNA相應的DNA片段，分子克隆到BLOCK.It Lemiviral PolⅡ miRNAi表達載體，并驗證Cx37

6、i體內體外的基因沉默效應;選擇沉默最佳Cx37 siRNA。轉染HEK293細胞培養(yǎng)，通過同源重組，生成攜帶有Cx37 siRNA的病毒懸液。
　　第二部分研究目的:通過高脂飲食建立豬動脈粥樣硬化模型。
　　第三部分研究目的:血管內超聲檢測豬腹主動脈粥樣硬化斑塊，測量斑塊的體積斑塊性質后，局部定位注射Cx37 siRNA病毒懸液，兩月后觀察Cx37 siRNA對AS進程的影響。
　　1.材料與方法
　　1.1細胞

7、培養(yǎng)
　　HEK細胞系用先前報道的培養(yǎng)方法。所有細胞培養(yǎng)基都購自美國Gibco-BRL公司，HEK293細胞來自中國科學院的細胞庫。脂質體2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。3條野生型Cx37干擾片段、陰性對照組和P3xflag-Cx37都是用RNA干擾技術轉染質粒，與脂質體2000按摩爾比率5∶1混合。
　　1.2慢病毒載體的制備與篩選RNA干擾靶點
　　首先，據(jù)基因庫中豬Cx37基因中設定3條RNA干

8、擾的靶序列（分別為A，B，C），靶序列mm-Cx37-1:5'GGUUAACGGUGCUCUUCAU3'定位:209，靶序列mm-Cx37-si-2:5'CCAAGGACCUACAUGUAGA3'定位:488，靶序列mm-Cx37-si-3:5'CAGACCCUUACCCUGAACA3'定位:841。P3xflag-Cx37和P3xflag作為對照組。
　　第二步，將3條RNA干擾序列和對照組序列通過脂質體轉染HEK293細胞，7

9、2小時后收集細胞，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌三次，吸取PBS殘留液體，加入含有蛋白酶抑制劑0.2ml的放射免疫溶菌緩沖劑，在冰上放置30分鐘，用細胞刮棒從離心管在冰上分離出細胞1.5ml，4℃下超聲溶解細胞30s，12000轉/分鐘離心30分鐘后取上清液移至另一個干凈的微型離心管，置-20℃冰箱儲存。
　　第三步，用BCA測定蛋白濃聚物:使用96孔BCA蛋白含量測定試劑盒。A液與B液50∶1混合，在室溫下放置30分鐘后每孔加入200μL

10、，加入標準樣品牛血清白蛋白和10μL蛋白樣品（1∶10稀釋度），空白孔加入雙蒸餾水10uL調節(jié)至0，在37℃酶標儀器里放置30分鐘后測定570nm吸光率，標準樣品作為標準曲線，計算所有蛋白樣品的濃聚度。
　　第四步，用Western blot法檢測siRNA干擾的有效性:10％ SDS-PAGE聚合物，每個樣品均量30ug;抗體標志，4℃過夜孵化;GAPDH監(jiān)測樣本的表達量。標志抗體∶家兔，1∶2000; GAPDH∶家兔，1∶1

11、0000抗體。所有細胞分為六組:實驗組:過表達空質粒組，Cx37質粒，過表達Cx37重組質粒，不同干擾片段。轉染試劑:脂質體2000轉染試劑;質粒:P3xflag，P3xflag-Cx37-0.4ug;干擾片段:50nM。轉染時間:72小時，根據(jù)Western blot結果篩選出最佳干擾片段。表達Cx37的慢病毒BLOCK制備—RNA干擾綠色熒光蛋白表達系統(tǒng)(GFP)(產(chǎn)品編號:K4948-00; Invitrogen)。將目前認為與哺

12、乳動物基因無同源性的亂序siRNA(稱為mock-siRNA)作為對照組。
　　根據(jù)基因沉默分析結果，選擇siRNACx37 B，C片段進行體外試驗研究，以小鼠單核巨噬細胞系RAW263.7為靶細胞將mock-LV、Cx372i，Cx373i的慢病毒載體轉染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞。病毒轉染五天后收集細胞進，通過熒光定量RT-PCR、Western blot分別檢測轉染細胞Cx37 mRNA水平和蛋白質水平的表達情況，篩

13、選出能有效阻斷Cx37基因表達的小分子干擾RNA載體。
　　1.3豬腹主動脈粥樣硬化模型建立
　　實驗共60只雄性家豬，均同批次購自中國五指山，正常飲食，自由飲水。一周后接受高脂飲食（5％豬油，1％糖，3％膽固醇，0.2％丙硫氧嘧啶），一日三餐，持續(xù)十個月。
　　1.4豬腹主動脈血管造影和血管內超聲(IVUS)分析
　　第8個月末，所有豬在麻醉后行腹主動脈血管造影和血管內超聲檢查。所有IVUS圖像均由20-MHz

14、 Volcano Eagle Eye IVUS導管(Volcano Therapeutics Inc，.RanchoCordova，CA，USA)采集。辨別腹主動脈粥樣硬化斑塊后，IVUS導管通過該區(qū)域遠端后以0.5毫米/秒的速度自動回撤?；爻啡淘赬線透視下監(jiān)測IVUS導管位置，利用IVUS成像記錄斑塊位置。為了獲得高質量的圖片，在持續(xù)的心電監(jiān)護下每個動脈平均會撤兩次，根據(jù)圖片的分辨率和質量選擇最好的一個循環(huán)圖像。IVUS虛擬組織學數(shù)

15、據(jù)記錄在硬盤，存檔后用于分析，分析以灰階圖為基礎。每個獨立圖片的組織圖分析由軟件提供支持（深綠色表示纖維組織，淺綠色代表纖維脂肪組織，紅色表示壞死的內核，白色代表鈣化）。在檢測的全長血管中選擇20mm血管片段平均分為10段2mm長的小片段用于分析。在此之后，打開腹腔、左結腸旁溝和小網(wǎng)膜，從腹主動脈上游離降結腸及其系膜至右側，通過定位，短暫阻斷上游血流，切開主動脈斑塊，定位，30°方向進針，隨機注射Cx37 siRNA病毒懸液、mock-

16、siRNA病毒懸液或生理鹽水。然后縫合血管及腹腔。所有豬均接受高脂飲食，Cx37 siRNA組，注射10μL Cx37慢病毒懸液。非治療組豬隨機分為mock-siRNA和鹽水亞組。Mock-siRNA注射10μLmock-siRNA，對照組注射不含病毒的生理鹽水。兩月后，所有豬接受腹主動脈造影和IVUS，分別用RT-PCR技術半定量測得Cx37 mRNA表達，Western-blot檢測Cx37蛋白表達量。所有用于本研究的動物均按照國際

17、衛(wèi)生組織指南規(guī)范使用。
　　1.5血脂水平及體重測定
　　在抽取眼靜脈竇血液，由無錫市人民醫(yī)院中心實驗室用氧化酶法測定血脂水平，包括總膽固醇(TC)，甘油三脂(TG)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，測定時間分別為高脂飲食喂養(yǎng)前，喂養(yǎng)8個月（注入siRNA前），喂養(yǎng)10個月（實驗結束）。同時間點測定體重。
　　2.數(shù)據(jù)分析
　　計量資料采用均值±標準差。兩組間連續(xù)變量采用獨立t

18、檢驗或方差分析。多組間變量比較采用ANOVA。所有檢驗采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件（北京雷安科技有限公司）。率及構成比比較采用卡方檢驗，當預期頻率小于5時采用Fisher精確檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
　　3.結果
　　3.1三組不同時間體重，血脂水平及肝腎功能
　　Cx37 siRNA組與非治療組(mock-siRNA亞組，生理鹽水亞組)豬的體重無差異，說明病毒轉染不影響豬的生長。同樣的，血清膽固醇和甘油

19、三脂水平也無差異，提示基因轉染的療效是獨立于血脂水平獨立存在的。另外，肝腎功能在組內、組間均無差異，提示SiRNACx37病毒轉染對豬肝腎功能無明顯影響。
　　3.2體外基因沉默:用Western blot法檢測Cx37沉默效果最佳的位點。
　　HEK293細胞株通過慢病毒轉染---基于載體表達的三種不同Cx37 siRNA1、2、3，基因沉默分析顯示，siRNA Cx372、3片段是沉默效果最好的干擾片段。根據(jù)結果，我們選

20、擇siRNA Cx372，3片段進行體外試驗研究。體外實驗結果顯示:結果表明siRNA372，3片段基因Cx37 mRNA水平的沉默效果分別是52％，50％，蛋白水平的抑制效果分別是83％，81％。據(jù)此，我們選擇siRNA Cx373片段進行體內試驗研究。
　　3.3豬腹主動脈粥樣硬化斑塊內有效的慢病毒轉染
　　預實驗局部病毒懸液注射腹主動脈粥樣硬化證實了轉染的有效性。用綠色熒光蛋白(GFP)表達水平是用于檢測慢病毒轉染有效

21、性。在腹主動脈粥樣硬化轉染一周后檢測到GFP熒光，表明轉染了siRNA，兩周后熒光增強，當實驗結束時，即轉染兩月后，GFP熒光即使微弱但仍可見。這些結果提示腹主動脈粥樣硬化斑塊轉染攜帶siRNA慢病毒的有效性。病毒的局部轉染不改變體重（34.89+4.16kg Cx37siRNA轉染組vs.34.54+3.87kg mock-siRNA亞組vs.31.96±4.84kg生理鹽水亞組）。
　　3.4體內基因沉默
　　用實時PC

22、R和Western-blot分析轉染siRNA慢病毒后腹主動脈粥樣硬化Cx37表達的水平。為評價體內慢病毒介導的基因沉默有效性，本實驗檢測豬腹主動脈粥樣硬化的Cx37 mRNA和蛋白表達水平。 Cx37mRNA水平在Cx37siRNA組下降到34％，mock-siRNA組下降到61％，生理鹽水組下降到94％(P＜0.05)，其中Cx37 siRNA組顯著下降。Western blot分析顯示Cx37蛋白表達水平在Cx37 siRNA干擾

23、組較其他組低（0.21±0.07 vs.0.65±0.06 vs.0.54±0.07）。由此可見，斑塊內應用siRNA Cx37慢病毒懸液能有效沉默Cx37。
　　3.5 IVUS檢測Cx37 siRNA在動脈粥樣硬化斑塊中的作用
　　10月時（注射Cx37 siRNA后兩月）斑塊壞死核心占比率較8月時（注射Cx37 siRNA前）降低（5.26±2.11 vs.7.83±1.03％，P＜0.05）。mock-siRNA和生

24、理鹽水組斑塊的壞死率在8月與10月間無差異(P=0.074，P=0.061)。Cx37 siRNA組斑塊體積較8月時減小(21.03±6.24 vs.31.23±10.23，P＜0.01)。相反，mock-siRNA和生理鹽水組，斑塊體積較8月時增大(38.54±13.56 vs.32.12±11.21 mm3，37.36±14.21 vs.30.21±12.02 mm3，P=0.031,P=0.027)。
　　結論: