高濃度碘對MT-Ⅰ-ⅡKO小鼠甲狀腺氧化應(yīng)激的實驗研究.pdf

1、目的:
　　研究高濃度碘對金屬硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠(MetallothioneinⅠ/Ⅱ Knockoutmice，MT-Ⅰ/Ⅱ KO mice)甲狀腺線粒體氧化應(yīng)激—抗氧化防御的影響，探討在有和沒有MT-Ⅰ/Ⅱ的情況下，高濃度碘對小鼠甲狀腺細(xì)胞氧化應(yīng)激—抗氧化防御的機(jī)制，并用碘轉(zhuǎn)運(yùn)的競爭抑制劑過氯酸鹽(KClO4)，促甲狀腺激素(thyrotropin，TSH)，TPO的抑制劑(抗甲狀腺藥丙基硫氧嘧啶(propylthioura

2、cil，PTU)進(jìn)行干預(yù)，研究高濃度碘對MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺線粒體氧化應(yīng)激—抗氧化防御的影響。
　　方法:
　　在細(xì)胞水平
　　1.制備同源對照小鼠(Wild type mice，WT mice)及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細(xì)胞懸液，分別給予10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-3mol/L H2O2處理2h，①利用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetra

3、zolium，MTT)比色法檢測細(xì)胞活力。②利用MitoSOX通過流式細(xì)胞術(shù)檢測甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物生成。③利用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清的LDH漏出率。④利用Western blot免疫印跡法檢測Prx3蛋白水平表達(dá)的變化。
　　2.用10-4mol/L KI加或不加30μmol/L KClO4處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物

4、生成、細(xì)胞活力、LDH漏出率。
　　3.用10-4mol/L KI加或不加300μmol/L PTU處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物生成、細(xì)胞活力、LDH漏出率。
　　4.用10-4mol/L KI加或不加10U/L TSH處理2h，檢測WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺細(xì)胞活力、LDH漏出率。
　　在動物水平
　　建立短期碘過量的動物模型，①適碘組(NI)②10倍碘過量

5、組(10HI)③100倍碘過量組(100HI)，喂養(yǎng)14天后開始實驗。
　　1.采用過硫酸銨消化砷鈰催化分光光度法測定尿碘含量。2.計算甲狀腺臟體比。3.HE染色觀察甲狀腺形態(tài)學(xué)變化。4.甲狀腺激素水平的測定。5.通過MTT法檢測細(xì)胞活力。6.利用LDH檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清的LDH漏出率。7.利用MitoSOX通過流式細(xì)胞術(shù)檢測甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物生成。
　　8.利用Western blot免疫印跡法檢測Prx3蛋白水平表

6、達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　在細(xì)胞水平
　　1.無論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-3mol/LH2O2可誘導(dǎo)小鼠甲狀腺細(xì)胞活力下降(P＜0.01)，LDH漏出率增加(P＜0.01)，線粒體超氧化物生成增多(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)分析顯示MT-Ⅰ/Ⅱ KO較WT小鼠的線粒體超氧化物生成增加更明顯(P＜0.01)。隨著KI濃度的增加，明顯增加了小鼠

7、甲狀腺Prx3的表達(dá)水平(P＜0.05)，且WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間有差異(P＜0.05)。
　　2.PTU、KClO4和TSH抑制高濃度碘誘導(dǎo)的MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲狀腺相對細(xì)胞活力的下降、LDH漏出率的增加、線粒體超氧化物生成的增加。
　　①無論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，KI(100μM)可誘導(dǎo)小鼠甲狀腺細(xì)胞的相對活力顯著下降。加入PTU(300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH(10U/L)處理后

8、，較單純KI(100μM)處理組，細(xì)胞活力顯著升高(P＜0.01)。與WT小鼠相比，MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠細(xì)胞活力降低更加明顯(P＜0.01)。
　?、跓o論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，PTU(300μM)、KClO4(30μM)和TSH(10U/L)可顯著抑制KI(100μM)誘導(dǎo)的線粒體超氧化物生成增多(P＜0.01)。WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，各種處理下MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠線粒體超氧化物生成升高更加明顯(P＜0.

9、05)。
　?、蹮o論WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，KI(100μM)可誘導(dǎo)小鼠甲狀腺細(xì)胞LDH漏出率顯著增加。加入PTU(300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH(10U/L)處理后，較單純KI(100μM)處理組，LDH漏出率顯著降低(P＜0.01)。與WT小鼠相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠LDH漏出率增加更加明顯(P＜0.01)。
　　在動物水平
　　1.小鼠在喂養(yǎng)到14天時，無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小

10、鼠中，3組尿碘水平隨攝入量增加依次成倍升高(p＜0.05)，與WT小鼠比較，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠尿碘濃度更高(p＜0.05)。
　　2.小鼠在喂養(yǎng)到14天時，臟體比顯示無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，NI組與100HI組之間有一定差異(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　3.無論在WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，10HI組和100HI組與NI組比較，血清甲狀腺激素T3、T4、FT3、FT4水平變化均

11、沒有顯著性差異(P＞0.05)，與WT小鼠比較，在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，100HI組血清FT4水平顯著升高(P＜0.05)。
　　4.在鏡下觀察，在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠和小鼠中，NI組和10HI甲狀腺多為中等大小濾泡，100HI組甲狀腺與NI組比較，表現(xiàn)為:有明顯的炎癥浸潤，既有部分濾泡明顯增大，部分濾泡接近正常略有增生;也有部分濾泡變小，濾泡腔變小，在WT小鼠中，表現(xiàn)更明顯。
　　5.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠

12、中，100HI組與NI組相比，細(xì)胞活力均明顯降低(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠細(xì)胞活力降低更明顯(p＜0.01)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　6.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，細(xì)胞損傷均明顯升高(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠細(xì)胞損傷升高更明顯(p＜0.01)，NI組與10HI組之間無明顯

13、差異。
　　7.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，線粒體超氧化物生成均明顯升高(p＜0.01)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠線粒體超氧化物生成升高更明顯(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　8.無論在WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中，100HI組與NI組相比，Prx3表達(dá)水平均升高(p＜0.05)，但WT與MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之間相比，MT-

14、Ⅰ/Ⅱ KO小鼠Prx3表達(dá)水平升高更明顯(p＜0.05)，NI組與10HI組之間無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.金屬硫蛋白Ⅰ/Ⅱ在高濃度碘誘導(dǎo)的甲狀腺氧化應(yīng)激和抗氧化防御中具有一定的保護(hù)作用。
　　2.在MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠，高濃度碘均可誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞線粒體超氧化物生成增加。
　　3.PTU（300μmol/L）可以減輕高濃度碘誘導(dǎo)的MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠甲狀腺細(xì)胞的氧化應(yīng)激。
　　4.K