食管鱗癌組織差異表達(dá)基因的篩查分析及研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)基因組學(xué)可以動(dòng)態(tài)、整體、定量地觀(guān)察腫瘤發(fā)生發(fā)展中基因種類(lèi)、數(shù)量的改變,結(jié)合功能基因組學(xué)的研究,依托基因表達(dá)譜的生物芯片和生物信息學(xué)分析技術(shù),以期找到食管鱗癌事件進(jìn)程中起關(guān)鍵作用的基因,并了解其在致食管鱗癌事件中的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集外科手術(shù)切除的5例食管鱗癌和配對(duì)5例正常食管粘膜新鮮組織標(biāo)本,應(yīng)用Agilent公司W(wǎng)holeHumanGenomeMicroarray4x44Kv2(全基因

2、組表達(dá)譜芯片)檢測(cè)食管鱗癌和配對(duì)食管粘膜全基因組的mRNA。通過(guò)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用軟件分析找出二者之間的差異表達(dá)基因(differentexpressedgenes,DEGs),對(duì)篩查出的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行基因本體(Geneontology,GO)功能富集度分析和Pathway功能分析,尋找與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因,初步構(gòu)建通過(guò)特定基因表達(dá)對(duì)腫瘤發(fā)展控制和治療的理論依據(jù)。
　　2.應(yīng)用RealtimePCR和免疫組織化學(xué)方法從mR

3、NA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)候選基因之一NEK6在食管鱗癌和配對(duì)正常粘膜組織的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。組織基因表達(dá)譜芯片結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量方法及免疫組化方法檢測(cè)候選基因NEK6在30例食管鱗癌及配對(duì)正常粘膜組織、94例食管鱗癌石蠟標(biāo)本的表達(dá),應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)候選差異表達(dá)基因NEK6表達(dá)狀態(tài)與臨床病理參數(shù)(如腫瘤浸潤(rùn)深度、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期)及預(yù)后關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.五例食管鱗癌組織及配對(duì)食管正常粘膜組織相比較

4、,所得基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)通過(guò)SAM軟件定義(癌)/(正常)表達(dá)倍數(shù)≥2且q<0.05的為差異表達(dá)基因,篩得1362個(gè)差異表達(dá)基因,其中444個(gè)上調(diào)表達(dá)、918個(gè)表達(dá)下調(diào)。選擇一個(gè)候選食管鱗癌組織中高表達(dá)基因NEK6進(jìn)行驗(yàn)證和臨床病理分析研究。
　　2.RealtimePCR結(jié)果顯示,與配對(duì)正常粘膜組織相比30例食管鱗癌病人中有20例NEK6mRNA表達(dá)上調(diào),其平均表達(dá)水平約為5.4倍(表達(dá)譜芯片為2.60倍)。免疫組化結(jié)果顯示94

5、例食管鱗癌組織中49例NEK6蛋白陽(yáng)性表達(dá),進(jìn)一步分析顯示NEK6蛋白表達(dá)狀態(tài)與腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)、臨床分期(P<0.001)及預(yù)后(P<0.001)密切相關(guān),但與患者年齡,性別、組織分化無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步的生存分析也證實(shí)NEK6的表達(dá)狀態(tài)與病人的預(yù)后密切相關(guān)(P<0.001)而且它可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)指標(biāo)判斷食管鱗癌病人的預(yù)后,NEK6蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性病人的五年生存率分別為14.3％(7/4

6、9)和64.4%(29/45)。
　　結(jié)論:
　　1.基因表達(dá)譜芯片能夠快速、高通量檢測(cè)食管鱗癌組織全基因組mRNA表達(dá)情況。與正常食管粘膜相比,食管鱗癌組織在轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)發(fā)生了巨大差異變化包括許多基因的上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá),檢測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步篩查和克隆與食管鱗癌密切相關(guān)基因提供了線(xiàn)索和理論依據(jù)。
　　2.應(yīng)用組織表達(dá)譜芯片結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證篩查差異表達(dá)基因,與正常粘膜組織相比,其中NEK6在食管