干性基因Lgr5在食管鱗癌中的表達(dá)及功能調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景
　　食管癌作為世界上第八大常見的惡性腫瘤，死亡率占世界第六位。在亞洲，食管鱗癌作為最主要的組織學(xué)類型，其5年生存率＜30％。目前主要以化療，放療，手術(shù)，靶向療法來治療食管鱗癌，但許多食管鱗癌病人仍出現(xiàn)疾病的復(fù)發(fā)、進(jìn)展和較差的預(yù)后。越來越多的證據(jù)證實(shí)腫瘤干細(xì)胞會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、治療耐藥和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤組織中具有自我更新增殖、多向分化的潛能以及可導(dǎo)致腫瘤形成進(jìn)展的生物學(xué)特性的一小部分未分化細(xì)胞。大量證據(jù)

2、證實(shí)富集和維持腫瘤干細(xì)胞特性可以通過低粘附無血清懸浮培養(yǎng)形成成球細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分選術(shù)分離腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物來獲得。
　　Lgr5作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，是Wnt信號通路的靶向調(diào)節(jié)基因。Lgr5由17個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個(gè)跨膜區(qū)域組成，具有GPCRs家族的典型特征。Barker等學(xué)者發(fā)現(xiàn)Lgr5表達(dá)于小腸和結(jié)腸的隱窩底部，經(jīng)過單一分選的Lgr5表達(dá)陽性的隱窩底柱狀細(xì)胞可以形成隱窩絨毛類器官。因此證實(shí)

3、Lgr5可被認(rèn)為是小腸干細(xì)胞和結(jié)腸干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。近年來研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、基底細(xì)胞癌和胃癌等。Wnt/β-catenin信號通路在正常干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞中均起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)被異常激活的Wnt/β-catenin通路與食管鱗癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
　　目的
　　1.探討分析干性基因Lgr5在食管鱗癌組織、食管鱗癌細(xì)胞和具有干性較強(qiáng)的食管鱗癌成球細(xì)胞中的表達(dá)

4、及臨床意義；
　　2.通過腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因在食管鱗癌成球細(xì)胞中的過高表達(dá)和較高的裸鼠體內(nèi)成瘤能力證實(shí)食管鱗癌成球細(xì)胞具備較高的干細(xì)胞特性；
　　3.采用siRNA使Lgr5的表達(dá)降低，分析食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力、干細(xì)胞基因表達(dá)以及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子表達(dá)能力的變化。
　　方法
　　采用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測280例食管鱗癌組織和150例癌旁組織中Lgr5的蛋白表達(dá)水平；K

5、aplan-Meier分析法分析食管鱗癌患者的生存預(yù)后；低黏附懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞系 KYSE450形成成球細(xì)胞；Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)、Western Blot法檢測干性相關(guān)基因以及Lgr5在親代細(xì)胞和成球細(xì)胞中的表達(dá)差異；BALB/c裸鼠體內(nèi)注射親代細(xì)胞和成球細(xì)胞檢測成球細(xì)胞干性；應(yīng)用Lgr5 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KYSE450細(xì)胞系后，CCK8檢測細(xì)胞增殖、Transwell實(shí)驗(yàn)

6、檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，qRT-PCR、Western Blot法檢測干性相關(guān)基因和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果
　　1.Lgr5在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常食管組織；且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腫塊大小、分化程度、腫瘤分期和較差的預(yù)后密切相關(guān)；
　　2.在食管鱗癌成球細(xì)胞中Lgr5和腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因均呈高表達(dá)水平；
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)成球細(xì)胞具有較高的致

7、瘤能力；
　　4.沉默Lgr5的表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力；
　　5.沉默 Lgr5的表達(dá)可以降低腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因 SOX2、ALDH1A1、NANOG的表達(dá)；
　　6.沉默Lgr5的表達(dá)可以降低β-catenin及其Wnt/β-catenin信號通路重要的分子cyclinD1、c-Myc的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　Lgr5可能是食管鱗癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志之一，Lgr5呈高表