17-AAG和YM155單獨及聯(lián)合應用對食管鱗癌細胞株Te-1的影響.pdf

1、背景:熱休克蛋白90(heatshockprotein90，HSP90)普遍存在于真核和原核細胞中，是一組高度保守的分子伴侶。研究證實，在多數(shù)惡性腫瘤組織中HSP90呈高表達狀態(tài)，在正常組織表達很低，目前HSP90已成為腫瘤治療的新靶點，其抑制劑也成為抗腫瘤研究的熱點。17-AAG是目前研究最多的HSP90抑制劑，已進入Ⅲ期臨床試驗。17-AAG可競爭HSP90ATP結合位點，HSP90內(nèi)源性ATP酶活性被抑制，導致HSP90作用的底物

2、蛋白不能與其結合而失去穩(wěn)定性，從而被蛋白酶水解。在體內(nèi)外抗腫瘤活性上17-AAG顯示出很好的效果，因而被廣泛關注。但關于17-AAG作用于食管鱗癌細胞的研究報道不多。
　　 HSP90底物蛋白眾多，其中很多是細胞信號傳導通路的關鍵蛋白，在腫瘤的發(fā)生和演進中起重要作用。在HSP90眾多的底物蛋白中，survivin是重要的一員。它是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的新成員，是目前發(fā)

3、現(xiàn)最強的凋亡抑制蛋白，在人的胚胎組織和幾乎所有人類常見惡性腫瘤組織中高表達，而在健康成人組織和終末分化組織表達水平很低，提示其與腫瘤的形成密切相關。近年來survivin也成為人們關注的抗腫瘤靶點。研究表明通過抑制其表達可有效地破壞腫瘤細胞的生存、發(fā)展，誘導其凋亡并降解。YM155是目前研究最成功的survivin的小分子拮抗劑，已進入Ⅱ期臨床試驗階段。YM155通過抑制survivin基因啟動子活性，抑制腫瘤細胞的生長增殖能力。目前Y

4、M155已在非小細胞肺癌、黑素瘤等腫瘤臨床試驗中取得一定效果，但對食管鱗癌細胞作用的相關報道很少。
　　 目的:本研究通過觀察17-AAG和YM155單獨及聯(lián)合作用于食管鱗癌細胞株TE-1，旨在探討兩種不同用藥方法在體外對細胞增殖、凋亡的影響以及HSP90和survivin在蛋白水平上的變化并分析其可能作用機制，為17-AAG、YM155在食管鱗癌治療中單獨及聯(lián)合臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細

5、胞培養(yǎng)
　　 用于實驗的食管鱗癌細胞株TE-1由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供，細胞以含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2.MTT法檢測細胞增殖活性
　　 分別以不同濃度的17-AAG、YM155單獨及聯(lián)合應用分別處理TE-1細胞，以不含藥物的TE-1細胞為對照組，作用細胞24h、48h、72h后，檢測對細胞增殖的抑制率。
　　 3

6、.流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡率
　　 流式細胞術PI單染的流式細胞學方法定量分析對照組和經(jīng)不同濃度的17-AAG、YM155單獨及聯(lián)合應用分別處理TE-1細胞48h后的凋亡率。
　　 4.蛋白免疫印跡(Westernblot)檢測HSP90和survivin蛋白表達水平
　　 對照組和不同濃度的17-AAG、YM155單獨及聯(lián)合應用分別處理TE-1細胞后48h后，提取細胞總蛋白，采用westernblot方

7、法，檢測其HSP90和survivin蛋白的表達水平。
　　 5.統(tǒng)計
　　 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用(x)±s表示，對照組和單獨用藥組各組間均數(shù)比較應用單因素方差分析，聯(lián)合用藥組與單獨用藥組各組間均數(shù)比較應用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.MTT結果顯示:
　　 17-AAG、YM155(以終濃度0.02μM、0.2μM、2μM、20

8、μM和40μM的17-AAG和終濃度0.01nM、0.1nM、1nM、10nM和100nM的YM155)單獨作用于TE-1細胞24h、48h和72h后，隨著藥物濃度的增加分別在24h、48h、72h抑制率逐漸增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(Fig.1、2;Table1)，且呈時間和劑量依賴性。
　　 17-AAG、YM155(以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17

9、-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155)聯(lián)合作用于TE-1細胞24h、48h和72h后，比單獨用藥組對TE-1細胞的抑制率明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(Fig.3-5、Table1、Table2-4)，提示兩者聯(lián)合用藥抑制增殖作用強于單獨用藥。
　　 2.流式細胞術結果顯示:
　　 單獨應用17-AAG和YM155

10、(以終濃度0.2μM、2μM和20μM的17-AAG和終濃度0.1nM、1nM和10nM的YM155)作用于TE-1細胞48h后，隨著藥物濃度的增加其凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(Fig.6、7;Table5)，且呈劑量依賴性。
　　 聯(lián)合應用17-AAG和YM155(以終濃度0.2μM17-AAG和終濃0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的Y

11、M155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155)作用于TE-1細胞48h后，聯(lián)合用藥組分別比單獨用藥組對TE-1細胞凋亡率明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(Fig.6-8;Table6)。提示聯(lián)合用藥促凋亡作用強于單獨用藥。
　　 3.Westernblot結果顯示:
　　 不同濃度的17-AAG和YM155單獨作用于TE-1細胞48h后，結果顯示:兩種藥物各個濃度組之間的

12、HSP90/GADPH灰度比值差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)。分別以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155聯(lián)合作用TE-1細胞，結果顯示各聯(lián)合用藥組與單獨用藥組之間的HSP90/GADPH灰度比值差異均

13、無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table8)。
　　 不同濃度的17-AAG和YM155單獨作用于TE-1細胞48h后，結果顯示兩種藥物各濃度組之間的Survivin/GADPH灰度比值差異有統(tǒng)計學意(P＜0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)，且隨著藥物濃度的增加，灰度比值逐漸降低，呈劑量依賴性。分別以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM15

14、5，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155聯(lián)合作用TE-1細胞，結果顯示各聯(lián)合用藥組與相應單獨用藥組之間Survivin/GADPH灰度比值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table9)。聯(lián)合用藥組的灰度比值明顯低于單獨用藥組，提示聯(lián)合用藥比單獨用藥更能下調(diào)survivin蛋白表達。
　

15、　 結論:
　　 1.17-AAG、YM155均能有效抑制TE-1細胞的增殖活性，且二者對TE-1細胞的增殖活性抑制作用均呈時間和劑量依賴性。
　　 2.17-AAG、YM155聯(lián)合應用比較單獨應用，對TE-1細胞增殖活性有更強的抑制作用。
　　 3.17-AAG、YM155均能促進TE-1細胞的凋亡，且二者對TE-1細胞的促凋亡作用均呈劑量依賴性。
　　 4.17-AAG聯(lián)合YM155對TE-1細胞有