Bufalin、β-欖香烯和PS-341對腎細胞癌的抗腫瘤作用及機理研究.pdf

1、目的：
　　 腎細胞癌約占成人惡性腫瘤的3％，發(fā)病時約30%病例為晚期。由于腎癌細胞高度表達耐藥基因，故對常規(guī)的化療無效。晚期腎癌的治療以免疫治療為主，但有效率僅10%左右。近年來開發(fā)的新型分子靶向藥物如舒尼替尼和索拉菲尼等，使得晚期腎癌的療效有了一定提高，但由于價格昂貴，多數(shù)患者難以負擔。因此，有必要尋找高效低毒，且價格相對低廉的新型抗腫瘤藥物，以進一步提高晚期腎癌的療效。
　　 Bufalin和欖香烯(elemene

2、)是從中藥中提取的抗癌有效成分，可抑制多種腫瘤細胞(如肺癌、結腸癌和膠質瘤)的增殖。但關于它們對腎癌有無抗腫瘤作用目前尚不清楚。硼替佐米(bortezomib，PS-341)是一種新型蛋白酶體抑制劑，已被美國食品與藥品管理局(FDA)批準用于多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的治療。小樣本臨床研究結果提示硼替佐米對轉移性腎細胞癌有效，但其具體抗腫瘤作用及機制需要進一步研究。
　　 細胞內調節(jié)增殖及凋亡的信號通路主要有核因子-κB(nuc

3、lear factor-κB，NF-κB)通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路和PI3K/Akt/mTOR通路等。這些信號傳導通路的活性對藥物的抗腫瘤作用具有重要的影響，抗癌藥物可通過改變這些通路的活性抑制細胞增殖，誘導凋亡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，位于Akt的下游，能激

4、活p70S6K1等來增強mRNA的轉錄和翻譯，進而增加一系列細胞生長相關蛋白的表達，引起細胞快速增殖。目前NCCN指南推薦的用于治療轉移性腎癌的藥物中有兩種是mTOR抑制劑，可見mTOR是治療腎癌的重要靶點。mTOR還是自噬的負性調控因子，抑制mTOR活性可誘導自噬發(fā)生。研究表明一些抗腫瘤藥物在誘導細胞凋亡的同時可激活自噬反應，抑制自噬可增強藥物的抗腫瘤作用。目前藥物誘導的保護性自噬已成為腫瘤耐藥的研究熱點。
　　 本研究以腎透

5、明細胞癌786-0細胞為模型，探討新型抗腫瘤藥物bufalin，β-欖香烯和PS-341對786-0細胞活力，凋亡及周期分布的影響，并進一步研究藥物對細胞內NF-κB、MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路活性的影響，以及對自噬的影響，以尋找治療腎癌的有效藥物。
　　 材料與方法：
　　 1.采用MTT方法測定細胞活力，繪制生存曲線。
　　 2.采用流式細胞術PI染色進行細胞凋亡及細胞周期檢測。
　　

6、3.采用Western blot法檢測蛋白的表達。
　　 4.采用透射電鏡技術觀察自噬的形態(tài)學變化。
　　 5.統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間差異采用Student's ttest分析。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果
　　 一、Bufalin、β-欖香烯和PS-341對腎細胞癌的抗腫瘤作用
　　 (一)傳統(tǒng)化療藥物及生物制劑對786-0細胞活力的影響
　　 不同

7、濃度的阿霉素(ADM)、順鉑(CDDP)作用于786-0細胞24 h，氟尿嘧啶(5-FU)作用于786-0細胞48 h，細胞活力僅輕度受抑制。與此類似，不同濃度的TNF和IL-2處理細胞24或48 h，細胞活力無明顯變化。
　　 (二)Bufalin、β-欖香烯及PS-341對786-0細胞活力的影響
　　 不同濃度的bufalin作用于786-0細胞24、48和72 h，抑制細胞50%的藥物濃度(IC50)分別為77.

8、62 nmol/L、24.46 nmol/L和14.43 nmol/L；β-欖香烯在24、48和72 h的IC50分別為145.60μg/mL，126.90μg/mL和63.84μg/mL；PS-341作用24 h細胞活力無明顯變化，48和72 h的IC50分別為55.17 nmol/L和19.93 nmol/L。這些數(shù)據(jù)提示bufalin，β-欖香烯和PS-341對腎癌786-0細胞有明顯的增殖抑制作用。
　　 (三)Bufa

9、lin、β-欖香烯及PS-341對786-0細胞凋亡及周期分布的影響
　　 流式細胞分析術結果顯示，bufalin和β-欖香烯作用786-0細胞24h后，凋亡細胞百分比明顯升高，與正常對照組相比P直均<0.05；G2/M期細胞比例無明顯變化。PS-341作用于細胞24或48 h，凋亡細胞百分比無明顯變化，而G2/M期細胞比例明顯升高，P<0.05。
　　 (四)Bufalin、β-欖香烯及PS-341對786-0細胞凋亡

10、相關蛋白表達的影響
　　 80 nmol/L的bufalin作用786-0細胞24 h，PARP明顯裂解，Bax/Bcl-2比值升高；150μg/mL的β-欖香烯作用細胞24 h后也可見PARP裂解，Bcl-2及Survivin蛋白表達下降，Bax表達無明顯變化；50 nmol/L的PS-341作用細胞24和48 h，PARP僅輕度裂解，Bcl-2、Bax表達無明顯變化，Survivin表達升高。
　　 二、Bufali

11、n、β-欖香烯和PS-341對細胞內信號傳導通路的影響
　　 (一)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對786-0細胞NF-κB通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯作用786-0細胞不同時間，IκBα蛋白表達水平無明顯變化，而PS-341作用后IKBa表達逐漸增加，提示bufalin和β-欖香烯對NF-κB通路活性無影響，而PS-341可抑制NF-KB通路活性。
　　 (二)Bufalin、β-

12、欖香烯和PS-341對ERK及JNK通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341均可一過性活化ERK通路，其中β-欖香烯和PS-341作用后ERK活性逐漸下調，之后低于正常水平，而bufalin對ERK活性無明顯抑制作用。Bufalin和β-欖香烯均可一過性活化JNK通路，而PS-341作用至24-48 h才明顯活化JNK通路。這些結果提示，ERK及JNK通路參與了三種藥物對786-0細胞的抗腫瘤過程。

13、　　 (三)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對786-0細胞PI3K/Akt/mTOR通路活性的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用細胞后，p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K1水平逐漸下降，至24或48 h明顯低與正常對照細胞，提示三種藥物通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路活性發(fā)揮對腎癌細胞的抗腫瘤作用。
　　 三、藥物誘導的保護性自噬拮抗對腎癌細胞的抗腫瘤作用
　　 (

14、一)Bufalin、β-欖香烯和PS-341對LC3蛋白表達的影響
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用786-0細胞24 h后，LC3-Ⅱ的表達水平明顯升高，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值升高，提示自噬反應發(fā)生。
　　 (二)Bufalin、β-欖香烯和PS-341誘導自噬小體形成
　　 Bufalin、β-欖香烯和PS-341作用細胞24 h，電鏡下可觀察到自噬小體，表現(xiàn)為細胞內的雙層膜小泡明顯增

15、多，泡內可見被吞噬的細胞內容物，此為自噬的典型形態(tài)學變化，提示藥物作用后可誘導自噬反應發(fā)生。
　　 (三)抑制自噬對藥物抗腫瘤活性的影響
　　 自噬抑制劑3MA或氯喹(CQ)預處理細胞1 h，再加入bufalin、β-欖香烯或PS-341繼續(xù)作用24或48 h，同藥物單獨處理組相比，加入自噬抑制劑可明顯降低細胞活力，提示抑制自噬可增強藥物的抗腫瘤活性。
　　 結論
　　 1.786-0細胞對傳統(tǒng)化療藥物及

16、生物制劑耐藥，而新型抗腫瘤藥物bufalin、β-欖香烯和PS-341對細胞有明顯的增殖抑制作用。
　　 2.Bufalin和β-欖香烯通過下調抗凋亡蛋白的表達誘導786-0細胞凋亡；PS-341主要誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯，對凋亡無明顯影響。
　　 3.Bufalin、β-欖香烯和PS-341通過影響ERK和JNK通路活性，發(fā)揮對細胞的抗腫瘤作用；Bufalin和β-欖香烯對NF-κB通路活性無明顯影響，而PS-34