中藥單體黃芩苷對(duì)衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、追溯中草藥發(fā)展,在我國(guó)已經(jīng)歷了幾千年的歷史長(zhǎng)河,是我國(guó)寶貴的純天然資源,目前種類已達(dá)12807種[1]。近年來(lái),隨著化學(xué)、生物學(xué)、藥理學(xué)和藥物分析學(xué)等現(xiàn)代學(xué)科的進(jìn)步,多學(xué)科、多技術(shù)對(duì)中藥的研發(fā)取得了長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展。特別是大量中草藥成分的分離、提純,藥物效應(yīng)學(xué)和藥物代謝學(xué)研究進(jìn)展,多種中藥單體及復(fù)合物成份廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療,發(fā)揮著重要的藥理作用。因此,中藥單體的制備及研發(fā)成為中藥現(xiàn)代發(fā)展的潮流,如何從眾多繁雜的大量中草藥中分離出不同有效

2、的單體成分、以及從大量單體庫(kù)中篩選出具有良好藥理作用的單體成分,是現(xiàn)代藥物研發(fā)的重要方向。目前,部分中藥單體成分已被證實(shí)具有改善心腦供血、減輕缺血性損傷、抗凋亡等作用應(yīng)用于臨床[2,3]。課題組前期已經(jīng)證實(shí)了氯離子通道參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程,阻斷其通道能夠有效抑制凋亡的發(fā)生[4],為此我們?cè)诜e極尋找具有氯離子通道阻斷作用的中藥單體成分,進(jìn)行前期探討。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器,它由封閉

3、的膜系統(tǒng)及其圍成的腔形成互相溝通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),參與了新生肽鏈的折疊、合成及蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?。研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖能量不足、病毒感染等各種刺激都會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài),破壞蛋白質(zhì)的加工及出現(xiàn)鈣耗損;衣霉素、膽固醇的積累通過(guò)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細(xì)胞凋亡[5,6]。在缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死及心力衰竭等心血管疾病均有ER應(yīng)激的廣泛參與[7-10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后,通過(guò)感應(yīng)調(diào)節(jié)分子伴侶GRP78表達(dá),CHOP、磷酸化JNK

4、的上調(diào)引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[11]。黃芩苷(Baicalin,BC)是一種黃酮類化合物,為一種功效廣泛中藥單體。BC具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等細(xì)胞保護(hù)作用[12]。BC是否能作用于心肌細(xì)胞,與細(xì)胞膜受體結(jié)合?BC是否具有抑制ERS的功效而發(fā)揮細(xì)胞的保護(hù)作用?目前不得而知,尚未任何研究報(bào)道。為此,本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上應(yīng)用高通量細(xì)胞膜色譜法對(duì)部分中藥單體成分進(jìn)行初步篩查,獲得能夠與細(xì)胞膜結(jié)合穩(wěn)定的中藥單體為候選成分。在此基礎(chǔ)上探討黃芩苷在衣

5、霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞損傷中的作用及可能的機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.應(yīng)用高通量細(xì)胞膜色譜法觀察部分中藥單體是否與細(xì)胞膜受體穩(wěn)定結(jié)合。
　　2.探討黃芩苷對(duì)衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)采用生物學(xué)特性穩(wěn)定的原代培養(yǎng)法并合理性分組:常規(guī)獲取SD大鼠新生鼠(0-3 Day)心肌細(xì)胞,進(jìn)行原代爬片培養(yǎng)心肌細(xì)胞12小時(shí),提供實(shí)驗(yàn)用。
　　2.生物親

6、和色譜技術(shù):細(xì)胞膜色譜法觀察作用于細(xì)胞生物膜的45種中藥單體成分與細(xì)胞膜受體的結(jié)合。采用原代細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)適量細(xì)胞,經(jīng)過(guò)多種程序逐步溶解細(xì)胞得到完整的細(xì)胞膜,隨后將制備好的細(xì)胞膜固定到活性硅膠上,裝柱得到穩(wěn)定活性的細(xì)胞膜色譜柱,在流動(dòng)相為水介質(zhì)、流速0.2mL/min條件下,DAD檢測(cè),經(jīng)過(guò)光電信號(hào)轉(zhuǎn)化,出現(xiàn)色譜圖,根據(jù)出現(xiàn)峰值時(shí)間可以判斷單體與細(xì)胞膜受體結(jié)合程度。
　　3.黃芩苷對(duì)衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞損傷的影響,分組設(shè)

7、立對(duì)照組、Tm組、Tm+BC組和BC組。MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率,LDH檢測(cè)細(xì)胞損傷程度,TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)CHOP、caspase-3、磷酸化JNK蛋白水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.利用生物親和色譜技術(shù)細(xì)胞膜色譜法從45種中藥單體中僅觀察到6種中藥單體成分能作用于細(xì)胞膜受體。它們分別是:黃芩苷、6-姜酚、白屈菜紅堿、延胡索乙素、白花前胡甲素和槐定堿。其中中藥單體黃芩苷能穩(wěn)定的與細(xì)胞膜受

8、體結(jié)合,是6個(gè)單體中唯一具有心血管藥物效應(yīng)的中藥單體,為此,以它為觀察目標(biāo)藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　2.Tm能夠損傷心肌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。與對(duì)照組相比,濃度為100ng/mL衣霉素分別作用于48h、72h、96h時(shí)心肌細(xì)胞存活率分別是80％、60%、50%,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞損傷性指標(biāo)LDH顯著增加,分別是38%、57%、60%,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白

9、CHOP的表達(dá)及細(xì)胞凋亡TUNEL水平變化,提示衣霉素激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,100 ng/ml、作用72小時(shí)為衣霉素內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡模型的實(shí)驗(yàn)條件,成功構(gòu)建了衣霉素誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞模型。
　　3.與Tm組相比,BC預(yù)處理組呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。細(xì)胞存活率在BC預(yù)處理不同濃度組中25μmol/L、50μmol/L與100μmol/L分別是65%、80%、85%,提示BC處理能夠顯著抑制Tm對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,使心肌細(xì)胞存

10、活率增加(P<0.05)。加用濃度為25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L黃芩苷處理后細(xì)胞損傷性指標(biāo)LDH含量分別是45%、38%、36%,提示BC處理能夠顯著抑制Tm對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,起到保護(hù)細(xì)胞的作用;同時(shí),BC預(yù)處理不同濃度組呈現(xiàn)明顯的抑制Tm誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、磷酸化JNK、CHOP的表達(dá)(P<0.05),使細(xì)胞凋亡的TUNEL水平明顯下調(diào)(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。
　　結(jié)論