17AAG對肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制及其機(jī)制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，對化療和放療均不敏感，手術(shù)根治率低，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因此尋求肝腫瘤的靶向藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。
　　近年來有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在肝癌中過度表達(dá)，并且牽涉腫瘤增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移及死亡。17AAG(17-allylamino-demethoxy geldanamycin)屬于苯醌類安沙霉素，能夠與ATP競爭熱

2、休克蛋白90(heat shock protein90，HSP90)N-末端區(qū)域的核苷酸連接位點(diǎn)，以更高的親和力與HSP90保守的N末端區(qū)域結(jié)合，這種結(jié)合抑制了底物蛋白的結(jié)合，從而抑制HSP90的ATP酶活性，并通過泛素蛋白酶途徑使許多客戶蛋白發(fā)生降解，發(fā)生細(xì)胞周期捕獲和凋亡。與惡性腫瘤相關(guān)的HSP90客戶蛋白包括ErbB2，Bcr-abl，estrogen receptors，androgenreceptors，c-RAF-1，CDK

3、4，AKT，mutant p53，MET，h-TERT和HIF-1α等，因?yàn)檫@些癌性“客戶蛋白”與許多腫瘤惡性特征有關(guān)，如使信號調(diào)節(jié)失調(diào)、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、永生化、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等，因此抑制HSP90將會(huì)對癌癥表型起著聯(lián)合阻斷作用。
　　本研究將17AAG作用于不同起源的肝癌細(xì)胞，探索17AAG作用后熱休克因子、熱休克蛋白和HSP90客戶蛋白表達(dá)的變化，觀察17AAG對不同起源肝癌細(xì)胞增殖抑制及其轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)而探索1

4、7AAG在肝癌中的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供了一定依據(jù)。
　　第一部分17從G對肝癌細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　目的：探索17AAG對正常肝臟細(xì)胞及不同起源肝癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡，以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。
　　方法：通過MTT法、軟瓊脂集落形成及檢測細(xì)胞周期觀察17AAG對細(xì)胞增殖能力的影響，通過流式細(xì)胞儀、Hoechst染色、PI/AnnexinⅤ雙染色檢測凋亡，應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwel

5、l實(shí)驗(yàn)檢測侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，并在荷瘤裸鼠體內(nèi)觀察17AAG對肝癌細(xì)胞增殖能力和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。
　　結(jié)果：17AAG對HL7702正常肝臟細(xì)胞生長無抑制作用，對其細(xì)胞周期及侵襲能力無影響，也不誘導(dǎo)凋亡。17AAG對肝母細(xì)胞瘤起源的HepG2細(xì)胞和原發(fā)性肝癌起源的MHCC-97H細(xì)胞生長均有抑制作用，影響細(xì)胞周期，降低其離散和侵襲能力，并誘導(dǎo)凋亡，能抑制兩株腫瘤細(xì)胞在裸鼠中皮下移植瘤的生長，并降低其肺、肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率。
　

6、　結(jié)論：適合劑量(1μ M)的17AAG對MHCC-97H細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均具有增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡和降低侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用，而對HL-7702正常肝臟細(xì)胞則無生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。因此，為17AAG應(yīng)用于肝癌的臨床研究提供了一定的依據(jù)。
　　第二部分17AAG影響熱休克蛋白及HSP90客戶蛋白的表達(dá)
　　目的：觀察17AAG作用后熱休克因子-1(HSF-1)、熱休克蛋白(HSP27，HSP70和HSP90)表達(dá)的變化

7、，以及對其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白c-Met，AKT和c-Met信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。
　　方法：17AAG作用于正常肝臟細(xì)胞HL7702、低轉(zhuǎn)移潛能HepG2和高轉(zhuǎn)移潛能MHCC-97H，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法蛋白定量，Western blot方法檢測HSF-1、熱休克蛋白和HSP90客戶蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：三株細(xì)胞中均可見HSF-1被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，除HepG2細(xì)胞低表達(dá)HSP27，17AAG作用后HS

8、P27、HSP70和HSP90表達(dá)均升高，且有隨著作用時(shí)間的延長而增加的趨勢。HepG2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞均高表達(dá)c-Met，PI3K，AKT和GSK-3β，但c-Met，PI3K，AKT隨著作用時(shí)間的延長而表達(dá)下降，而在HepG2細(xì)胞中GSK-3β則隨著作用時(shí)間的延長表達(dá)有所上升。HL7702細(xì)胞中雖可見c-Met，PI3K，AKT和GSK-3β有所表達(dá)，但17AAG對其表達(dá)并無影響。
　　結(jié)論：17AAG不但能夠抑制H

9、SP90客戶蛋白c-MET和AKT的表達(dá)，而且能夠抑制c-Met信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)因子的表達(dá)，17AAG對正常肝臟細(xì)胞中HSP90客戶蛋白表達(dá)無影響，因此17AAG可通過抑制其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。HSP27低表達(dá)的肝癌細(xì)胞對17AAG更敏感，提示HSP27表達(dá)水平可作為評價(jià)腫瘤細(xì)胞對17AAG敏感性的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。
　　第三部分下調(diào)HSP27表達(dá)對17AAG藥物敏感性的影響
　　目

10、的：應(yīng)用siRNA作用于HSP27高表達(dá)的MHCC-97H肝癌細(xì)胞，觀察下調(diào)HSP27表達(dá)后能否提高肝癌細(xì)胞對17AAG的敏感性。
　　方法：MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后MHCC-97H細(xì)胞IC50的變化，提取總蛋白，應(yīng)用BCA法蛋白定量，Western blot方法檢測HSP27、HSP70和HSP90轉(zhuǎn)染前后表達(dá)的變化，并檢測HSP90客戶蛋白c-Met和AKT表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染后IC50值下降，MHCC-97H細(xì)胞轉(zhuǎn)

11、染前后IC50分別為3.3434±0.1973μM和1.2297±0.1208μ M(p<0.01)。siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HSP27表達(dá)有所下降，而HSP70和HSP90表達(dá)仍然上升，HSP90客戶蛋白c-Met和AKT的表達(dá)仍是受抑制的。
　　結(jié)論：抑制肝癌細(xì)胞HSP27的表達(dá)，可增加腫瘤細(xì)胞對17AAG的敏感性。轉(zhuǎn)染后HSP27表達(dá)下降，但并不影響HSP70、HSP90和HSP90客戶蛋白的表達(dá)，說明IC50的下降僅與抑制H

12、SP27表達(dá)有關(guān)。
　　第四部分SMMC/SF7721肝癌細(xì)胞中17從G對其增殖轉(zhuǎn)移的抑制及機(jī)制研究
　　目的：探索17AAG對來自同一親本SMMC7721與SF7721肝癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡，以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。觀察在SMMC/SF7721細(xì)胞中17AAG對熱休克蛋白及其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)行機(jī)制的探討。
　　方法：MTT法觀察細(xì)胞對17AAG增殖能力的影響，Transwell實(shí)驗(yàn)檢

13、測細(xì)胞侵襲能力的變化，流式細(xì)胞儀(FCM)和PI/AnnexinⅤ方法檢測凋亡。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞降低HSP27表達(dá)后，應(yīng)用western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中HSP27、HSP70、HSP90及其HSP90客戶蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：17AAG能夠抑制SMMC/SF7721肝癌細(xì)胞的生長、抑制其侵襲能力并誘導(dǎo)凋亡。17AAG作用于SMMC/SF7721細(xì)胞后可誘導(dǎo)HSF-1上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)HSP27、HSP70和HS

14、P90的表達(dá)，SF7721細(xì)胞中c-met的表達(dá)明顯高于SMMC7721，但17AAG仍然能夠抑制其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白的表達(dá)，如c-met、AKT等，在SMMC/SF7721細(xì)胞中均高表達(dá)HSP27，應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)HSP27表達(dá)后可提高17AAG的敏感性，且不受HSP70、HSP90及HSP90客戶蛋白表達(dá)的影響。SMMC7721細(xì)胞中17AAG加control-siRNA或HSP27-siRNA的IC50值分別為(4.33

15、58±0.1184)μM和(1.4447±0.1199)μ M(p<0.01)，SF7721細(xì)胞中17AAG加control-siRNA或HSP27-siRNA的IC50值分別為(2.7240±0.1137)μ M和(1.1692±0.1016)μ M(p<0.01)。
　　結(jié)論：在c-met高表達(dá)的SF7721細(xì)胞中17AAG仍可抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力，因此17AAG是通過抑制其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白的表達(dá)而

16、發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)靶向抑制HSP27的表達(dá)仍可提高17AAG的敏感性。
　　總結(jié)
　　本研究中17AAG對正常肝臟細(xì)胞無生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，而對不同起源的肝腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用，影響細(xì)胞周期，降低其離散和侵襲能力，并誘導(dǎo)凋亡，腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠后形成皮下移植瘤，17AAG抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，并降低其肺、肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率。17AAG作用于正常肝臟細(xì)胞后上調(diào)熱休克蛋白的表達(dá)，但對其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白表達(dá)并無影響

17、，17AAG作用于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721以及高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞MHCC-97H和SF7721后上調(diào)熱休克蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制其靶點(diǎn)HSP90客戶蛋白的表達(dá)。低表達(dá)HSP27的Hep62細(xì)胞IC50值低，在HSP27高表達(dá)的細(xì)胞中應(yīng)用siRNA抑制HSP27表達(dá)后可提高對17AAG的敏感性，而且并不影響其它熱休克蛋白和IHSP90客戶蛋白的表達(dá)。研究提示17AAG對正常肝臟細(xì)胞的增殖無明顯影響，對肝癌細(xì)胞的抑制作用