Ku80分子對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分研究Ku80分子表達(dá)對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接慘u80分子表達(dá)對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.從國(guó)外交流獲得pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達(dá)質(zhì)粒；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)菌；小量提取質(zhì)粒鑒定無(wú)誤后，繼續(xù)擴(kuò)增細(xì)菌，大量提取并純化質(zhì)粒，最后測(cè)序鑒定。
　　2.將pcDNA3.1

2、-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不表達(dá)Ku80的SMMC7721肝癌細(xì)胞中，通過(guò)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Ku80的細(xì)胞克隆，western blot鑒定Ku80蛋白表達(dá)陽(yáng)性的SMMC7721細(xì)胞克隆。
　　3.直接細(xì)胞計(jì)數(shù)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)Ku80的SMMC7721肝癌細(xì)胞克隆與對(duì)照細(xì)胞株的體外增殖能力。
　　4.將高表達(dá)Ku80的SMMC7721肝癌細(xì)胞克隆和對(duì)照細(xì)

3、胞株分別接種到裸鼠皮下，研究接種各組細(xì)胞形成皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況和裸鼠的生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.經(jīng)鑒定成功獲得可供細(xì)胞轉(zhuǎn)染用的pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　2. Western blot檢測(cè)證實(shí)成功篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)Ku80蛋白的細(xì)胞克隆3個(gè)：Ku80-18，Ku80-26和Ku80-33，及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞克?。╒ector）。
　　3.直接

4、細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，Ku80-18克隆細(xì)胞(1.715±0.242，×104)和Ku80-26克隆細(xì)胞(1.595±0.303，×104)在生長(zhǎng)至第5天的細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組Vector細(xì)胞(4.408±1.486，×104)或SMMC7721細(xì)胞(5.592±0.906，×104)相比明顯減低（p<0.01）；Ku80-18克隆細(xì)胞(2.223±0.481，×104)和Ku80-26克隆細(xì)胞(2.025±0.075，×104)在生長(zhǎng)第7天的細(xì)胞

5、數(shù)目與對(duì)照組Vector細(xì)胞(6.733±0.651，×104)或SMMC7721細(xì)胞(7.03±0.219，×104)相比明顯減低（p<0.01）。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，Ku80-18克隆細(xì)胞(53±7個(gè))和Ku80-26克隆細(xì)胞(50±7個(gè))在軟瓊脂中形成細(xì)胞克隆的數(shù)目與對(duì)照組Vector細(xì)胞(109±6個(gè))或SMMC7721細(xì)胞(117±9個(gè))相比明顯減低（p<0.01）。
　　4.裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)至44天，繪制其生長(zhǎng)曲

6、線發(fā)現(xiàn)，Ku80-18和Ku80-26克隆細(xì)胞形成的皮下瘤生長(zhǎng)速度在24天后明顯低于Vector或SMMC7721細(xì)胞（p<0.01）；第44天，Ku80-18克隆細(xì)胞(1.66±0.39cm3)和Ku80-26克隆細(xì)胞(1.50±0.31cm3)形成皮下瘤的平均體積與對(duì)照組Vector細(xì)胞(3.19±0.39 cm3)或細(xì)胞SMMC7721(3.04±0.51cm3)相比明顯減低（p<0.01）；Ku80-18克隆細(xì)胞(0.1425±

7、0.0712g)和Ku80-26克隆細(xì)胞(0.1300±0.0404g)形成皮下瘤的平均重量與對(duì)照組Vector細(xì)胞(0.5497±0.1273g)或SMMC7721細(xì)胞(0.6071±0.1729g)相比明顯減低（p<0.01）。Vector細(xì)胞接種的裸鼠中位生存時(shí)間為52.0±1.1天，Ku80-18細(xì)胞接種的裸鼠中位生存時(shí)間為69.0±2.2天；Ku80-18組裸鼠與Vector組裸鼠相比中位生存時(shí)間延長(zhǎng)率為32.8％；Vecto

8、r和Ku80-18細(xì)胞接種裸鼠的中位生存時(shí)間的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　第二部分研究Ku80分子表達(dá)對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖影響的分子機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯縆u80表達(dá)對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖影響的可能分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)Ku80的SMMC7721細(xì)胞克隆和對(duì)照細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)Ku80的SMMC772

9、1細(xì)胞克隆和對(duì)照細(xì)胞株的凋亡水平。
　　3. Western blot檢測(cè)高表達(dá)Ku80的SMMC7721細(xì)胞克隆和對(duì)照細(xì)胞株細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　4. Western blot檢測(cè)高表達(dá)Ku80的SMMC7721細(xì)胞克隆和對(duì)照細(xì)胞株凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)接種各組細(xì)胞形成的裸鼠皮下瘤組織中細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平；TUNEL法檢測(cè)接種各組細(xì)胞形成的裸鼠皮下瘤組織中細(xì)胞凋亡水平。

10、r>　　6.將靶向干擾p53和p21表達(dá)的三個(gè)siRNAs分別命名為sip53-1，sip53-2，sip53-3和sip21-1，sip21-2，sip21-3.按照說(shuō)明書步驟，使用Lipofectamine2000將這些siRNAs轉(zhuǎn)染到Vector和Ku80-18細(xì)胞中；Western blot檢測(cè)干擾效果；將干擾后的各組細(xì)胞置于37℃5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期分布（方法同前）。<

11、br>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布顯示，經(jīng)過(guò)10％胎牛血清刺激0,12,24,36和48小時(shí)后，Vector細(xì)胞的S期比率分別為37.10±3.83％、34.56±3.32％、34.89±4.24％,、39.8±5.48％和29.72±6.50％，Ku80-18細(xì)胞的S期比率分別為53.70±4.77％、71.88±4.46％、74.14±3.70％、85.46±4.08％和77.84±4.15％，兩組細(xì)胞在

12、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的S期比率差異都具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，SMMC7721細(xì)胞的凋亡比率是
　　1.81±0.15％,Vector細(xì)胞的凋亡比率是1.83±0.25％，Ku80-18克隆細(xì)胞的凋亡比率是9.44±1.52％，Ku80-26克隆細(xì)胞的凋亡比率是9.26±1.72％；Ku80-18克隆細(xì)胞和Ku80-26克隆細(xì)胞的凋亡比率與SMMC7721細(xì)胞或Vector細(xì)胞的凋亡比

13、率相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），而SMMC7721細(xì)胞與Vector細(xì)胞的凋亡比率相比差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），Ku80-18細(xì)胞克隆與與Ku80-26細(xì)胞克隆的凋亡比率相比差異也無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　3. Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ku80-18和Ku80-26細(xì)胞克隆中p53和p21蛋白的表
　　達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞SMMC7721或Vector相比明顯增高，cyc

14、linA和cdk2蛋白的表達(dá)水平減低，cylinE蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。
　　4. Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ku80-18和Ku80-26細(xì)胞克隆中cleaved PARP，caspase-3和caspase-8表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞SMMC7721或Vector相比明顯增高，Bcl-2表達(dá)水平減低，而Bax表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ku80-18細(xì)胞接種的裸鼠皮下瘤組織與Vector細(xì)胞接

15、種的裸鼠皮下瘤組織相比，p53和p21蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高（p<0.01），cyclinA和cdk2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(p<0.01)，cyclinE蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。TUNEL法檢測(cè)裸鼠皮下瘤組織的細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn)，SMMC7721組的凋亡率是3.5±1.0％，Vector組的凋亡率是3.6±1.1％，Ku80-18組的凋亡率是9.3±2.0％，Ku80-26組的凋亡率是10.0±2.1％

16、；Ku80-18組和Ku80-26組的凋亡率與SMMC7721組或Vector組相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），SMMC7721組的凋亡率與Vector組相比差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），Ku80-18組凋亡率與Ku80-26組相比差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　6.細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，Ku80-18細(xì)胞在轉(zhuǎn)染sip53-3或sip21-172小時(shí)后S期的比率與Vector細(xì)胞相比差異無(wú)顯著的統(tǒng)

17、計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。此外，Vector細(xì)胞在轉(zhuǎn)染mock，sip53-3或sip21-1后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的S期比率差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Ku80-18細(xì)胞在敲減p53或p21分子表達(dá)第5天后的細(xì)胞數(shù)目與轉(zhuǎn)染mock的Ku80-18細(xì)胞相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。與轉(zhuǎn)染mock的Ku80-18細(xì)胞相比，Ku80-18細(xì)胞在轉(zhuǎn)染sip53-3或sip21-1后生長(zhǎng)至第5天細(xì)胞數(shù)目

18、平均增加253％或245％。轉(zhuǎn)染mock，sip21-1和sip53-3的Vector三組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，細(xì)胞數(shù)目在各組間差異均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆重復(fù)三次，以上所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，并應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)，分類變量的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，采用Kaplan Meier法進(jìn)行生

19、存分析，若p<0.05則認(rèn)為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1.在體外增殖實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)Ku80蛋白可明顯抑制SMMC7721細(xì)胞株的增殖能力。
　　2. Ku80高表達(dá)可引起SMMC7721肝癌細(xì)胞阻滯在S期，并伴隨著細(xì)胞凋亡增加。
　　3. Ku80高表達(dá)可上調(diào)p53和p21蛋白表達(dá)水平。
　　4. Ku80抑制肝癌細(xì)胞增殖和引起細(xì)胞周期S期阻滯的分子機(jī)制依賴于p53-p21