七氟醚對老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及其與Egr1、CREB表達(dá)與激活的關(guān)系.pdf

1、術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是手術(shù)麻醉后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，增加了家庭和社會負(fù)擔(dān)。老年人的大腦發(fā)生了廣泛的結(jié)構(gòu)和生理性改變，與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)樹突棘形態(tài)改變、細(xì)胞間連接以及鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、基因表達(dá)改變。這些因素導(dǎo)致老年腦的突觸可塑性改變，進(jìn)而對各種全身麻醉藥的敏感性增加。Moller等研究發(fā)現(xiàn)60歲以上人群POCD發(fā)生率在1周內(nèi)為25.8％

2、，3個月時為9.9％。POCD的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但基本確定老年是術(shù)后長期認(rèn)知功能障礙的危險因素。近年來，七氟醚在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。但有研究表明七氟醚可導(dǎo)致凋亡，增加beta-amyloid protein levels(Aβ)的水平，并可通過活化特定激酶增加tau蛋白磷酸化并可引起空間記憶缺陷。在長時程增強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)早期合成的絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-act

3、ivated protein kinases/ extracellular regulated proteinkinases，MAPK/ERK)通過調(diào)節(jié)環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)磷酸化而促進(jìn)早期生長反應(yīng)因子-1(earlygrowth response factor1，Egr1)的合成，從而形成和鞏固晚期長時程增強(qiáng)(LTP)。這一通路在長時程記憶形成和鞏

4、固過程中起重要作用。因此，這一通路可能參與七氟醚致認(rèn)知功能減退過程并起重要作用，本文從以下幾個方面進(jìn)行論述。
　　第1部分 老年小鼠海馬內(nèi)pCREB和Egr1的表達(dá)與鞏固的空間記憶的提取有關(guān)
　　目的：
　　研究老年小鼠海馬內(nèi)磷酸化環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(phosphorylationof the cAMP response element binding protein，pCREB)和早期生長反應(yīng)因子-1(earl

5、y growth response factor1，Egr1)表達(dá)與鞏固的水迷宮空間記憶的提取之間的關(guān)系。
　　方法：
　　選擇18月齡雄性C57/BL6小鼠24只，隨機(jī)分為4個組，①不進(jìn)行訓(xùn)練也不進(jìn)行空間探索試驗組（空白組）;②不進(jìn)行訓(xùn)練但進(jìn)行同樣的空間探索試驗（NTPRT組）;③進(jìn)行訓(xùn)練并進(jìn)行空間探索試驗（PRT組）;④進(jìn)行訓(xùn)練但不進(jìn)行空間探索試驗（NPRT組）。水迷宮訓(xùn)練過程包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。首先

6、進(jìn)行3天適應(yīng)訓(xùn)練，主要包括適應(yīng)水溫和周圍環(huán)境。定位航行試驗(place navigation test)歷時14天，小鼠尋找平臺的最大時限設(shè)定為60秒，小鼠在平臺停留60秒，以提供時間讓小鼠觀察周圍提示物，然后開始下一次訓(xùn)練。空間探索試驗分別在第4天、第7天、第11天和第14天進(jìn)行。系統(tǒng)自動分析包括逃避潛伏期、平臺象限游泳時間與總時間之比等參數(shù)。在本實驗中主要用于比較的是空間探索實驗中平臺象限游泳時間占總時間百分比。在空間探索試驗中平臺

7、象限游泳時間占總時間百分比超過30％認(rèn)為小鼠對提示物和平臺空間位置關(guān)系形成記憶。NTPRT組和PRT組在第15天再次進(jìn)行空間探索試驗，而空白組和NPRT組不接受空間探索試驗。四組小鼠于空間探索試驗結(jié)束后15min水合氯醛深度麻醉，經(jīng)左心進(jìn)行灌流后剝離腦組織，通過免疫熒光的方法檢測位置回想測試是否會引起Egr1和pCREB在海馬CA1和CA3區(qū)內(nèi)表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.水迷宮行為學(xué)結(jié)果
　　通過為期14天的水迷宮訓(xùn)練

8、，NPRT組和PRT組小鼠對平臺位置都形成了良好的空間鞏固記憶，從第1天到第14天小鼠逐漸學(xué)會了平臺的位置，這一點可以從逐漸縮短的逃逸潛伏期（從第1天到第13天）和空間探索試驗中逐漸增加的平臺象限時間百分比（從第4天到第14天）得出，從第1天到第14天的訓(xùn)練的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，逃逸潛伏期顯著下降（F9，126=22.08，p＜0.0001），最主要的效應(yīng)在第12天(F=152.41，p＜0.0001);從第4天到第14天的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示平

9、臺象限的時間百分比顯著增加(F3，39=11.32，p＜0.0001)，達(dá)到漸進(jìn)水平是在第11天。在第4天，第7天，第11天，第14天通過空間探索試驗對平臺位置的記憶進(jìn)行評估。目標(biāo)象限的時間百分比與對立象限的時間百分比進(jìn)行比較，后者比前者顯著下降(t=229.448，p＜0.0001)，說明對平臺已形成記憶。第14天，PRT組和NPRT組小鼠之間的表現(xiàn)沒有差別(t=0.075，p=0.789)。在整個訓(xùn)練過程中，沒有小鼠有趨觸行為和漂浮

10、行為，統(tǒng)計分析顯示訓(xùn)練過程中各組小鼠的游泳速度沒有顯著性差別(F＜1，p＞0.3)。
　　2.免疫組化結(jié)果
　　第15天在最后一次空間探索試驗后15分鐘所有小鼠處死取腦，進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果如下:①NPRT組和PRT組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜

11、0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組比PRT組顯著降低(p＜0.05)。②NPRT組、PRT組與NTPRT組、空白組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NPRT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NP

12、RT組和PRT組比空白組和NTPRT組顯著升高(p＜0.05)。③NTPRT組和空白組比較:pCREB在CA1區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無顯著性差異(p＞0.05);pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無顯著性差異(p＞0.05);Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無顯著性差異(p＞0.05);Egr1在CA3區(qū)的表達(dá)NTPRT組和空白組比較，兩組之間無顯著性差異(p＞0.

13、05)。④海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)比較:所有組別中pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)量顯著高于CA1區(qū)(p＜0.05);所有組別中Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)量顯著高于CA3區(qū)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　?、僭谒詫m訓(xùn)練中，空間記憶鞏固后進(jìn)行提取與老年小鼠海馬內(nèi)pCREB和Egr1的表達(dá)相關(guān);
　?、诶夏晷∈蠛ｑR內(nèi)pCREB在CA3區(qū)的表達(dá)量明顯高于CA1區(qū)，而Egr1在CA1區(qū)的表達(dá)量明顯高于CA3區(qū)。
　　第2部分

14、七氟醚麻醉后老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶缺陷與海馬內(nèi)pCREB和Egr1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)
　　目的：
　　麻醉藥物與術(shù)后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系是目前研究的熱點，但具體的機(jī)理還不清楚，而海馬內(nèi)pCREB和Egr1對晚期長時程增強(qiáng)或長時記憶的形成至關(guān)重要，為了更好地了解吸入麻醉藥對中樞神經(jīng)的影響，我們研究老年小鼠七氟醚麻醉4h后的行為學(xué)改變以及海馬內(nèi)pCREB和Egr1表達(dá)的變化。
　　方法：
　　18月齡老年小鼠隨機(jī)分入麻醉組和

15、對照組，麻醉組小鼠3％七氟醚麻醉4h，而對照組吸入100％的氧氣4小時，水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力測量在麻醉后48小時進(jìn)行，定位航行試驗為期6天，定位航行試驗結(jié)束后即刻進(jìn)行空間探索試驗，試驗結(jié)束后15min，兩組小鼠深度麻醉后同時斷頭取腦，快速分離腦組織取海馬，通過western blot和RT-PCR方法檢測兩組小鼠海馬內(nèi)Egr1和pCREB表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1、水迷宮行為學(xué)結(jié)果
　　通過為期6天的定位航行

16、訓(xùn)練，對照組在第4、5和第6天比麻醉組能更快找到平臺，差別有顯著性（所有p＜0.05）;在空間探索試驗中，對照組平臺象限時間百分比顯著高于麻醉組(p＜0.01)。
　　2、免疫印跡結(jié)果
　　①麻醉組小鼠海馬內(nèi)pCREB的表達(dá)量顯著下降(p＜0.01);②麻醉組小鼠海馬內(nèi)Egr1的表達(dá)量顯著下降(p＜0.05)。
　　3、RT-PCR結(jié)果
　?、賰山M小鼠海馬內(nèi)CREB mRNA表達(dá)量之間沒有顯著差異(p＞0.05)