二甲雙胍對(duì)肺腺癌細(xì)胞系PC9、PC9-GR增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)及吉非替尼增敏作用的研究.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)是我國(guó)高發(fā)腫瘤，其發(fā)病率位居男性腫瘤患者的第一位、女性腫瘤患者的第二位。手術(shù)、放療、化療是NSCLC的傳統(tǒng)治療手段。近年來(lái)，隨著對(duì)NSCLC發(fā)病機(jī)制研究的深入，表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)信號(hào)通路在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用不斷被認(rèn)識(shí)?；诖税l(fā)展起來(lái)的靶向EGFR信號(hào)通路的靶向治療已應(yīng)用

2、于NSCLC的臨床治療。靶向治療因其治療效果好，副作用相對(duì)較小，已成為NSCLC的一種重要治療手段。然而，患者接受一定時(shí)間的治療后，幾乎不可避免地出現(xiàn)耐藥，而使治療失效，病情進(jìn)展。因此，尋找延緩、逆轉(zhuǎn)靶向治療耐藥的方法是當(dāng)前靶向治療領(lǐng)域的一個(gè)重要問(wèn)題。
　　二甲雙胍是目前廣泛使用于Ⅱ型糖尿病治療的一種胰島素增敏劑。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除對(duì)Ⅱ型糖尿病的治療作用外，在心血管疾病、多囊卵巢綜合癥及腫瘤的預(yù)防和治療中可能發(fā)揮重要作用

3、。二甲雙胍與腫瘤的關(guān)系尤其受到重視。越來(lái)越多的證據(jù)表明，二甲雙胍可能具有抑制腫瘤增殖，改善腫瘤對(duì)化療藥物敏感性的作用。本實(shí)驗(yàn)用二甲雙胍作用于人肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞，觀察其對(duì)不同EGFR突變狀態(tài)的肺腺癌細(xì)胞增殖抑制作用，及其對(duì)PC9/GR細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。
　　第一章：二甲雙胍對(duì)肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用
　　研究目的:研究二甲雙胍對(duì)人肺腺癌PC9

4、、PC9/GR細(xì)胞抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)
　　研究方法:以不同濃度二甲雙胍干預(yù)PC9、PC9/GR細(xì)胞，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.MTT比色法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍作用于PC9，PC9/GR細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的提高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物對(duì)PC9、PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。且二甲雙胍對(duì)PC9的增殖抑

5、制作用與對(duì)PC9/GR的增殖抑制作用無(wú)明顯差異。
　　2.不同濃度二甲雙胍(1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、10mmol/L)干預(yù)PC9、PC9/GR細(xì)胞48h后，PC9細(xì)胞凋亡率由9.59％升高至25.94％，PC9/GR細(xì)胞凋亡率由7.28％上升至23.93％。各濃度二甲雙胍干預(yù)組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、體外實(shí)驗(yàn)證明，在一定濃度范圍內(nèi)，

6、二甲雙胍對(duì)人肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞株具有抑制增殖作用，其作用具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　2、二甲雙胍在體外可誘導(dǎo)PC9、PC9/GR發(fā)生凋亡，其作用具有濃度依賴性。
　　第二章：二甲雙胍對(duì)肺腺癌PC9/GR細(xì)胞株吉非替尼敏感性的影響及其機(jī)制
　　研究目的:研究二甲雙胍對(duì)PC9/GR細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響及其可能機(jī)制。
　　研究方法:以5μmmol/L吉非替尼聯(lián)合不同濃度二甲雙胍作用于PC9/GR細(xì)胞48

7、小時(shí)，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，判斷不同濃度二甲雙胍對(duì)PC9/GR細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析二甲雙胍、吉非替尼、二甲雙胍+吉非替尼干預(yù)PC9/GR細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率的變化。Western Blot法檢測(cè) AMPK、p-AMPK、m-TOR、p-mTOR等有關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度二甲雙胍與吉非替尼聯(lián)用后，均能較單藥吉非替尼更強(qiáng)地抑制細(xì)胞增殖。兩藥表現(xiàn)為協(xié)同作用，且較

8、低劑量的二甲雙胍的協(xié)同效應(yīng)較強(qiáng)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2mmol/L二甲雙胍與5μmol/L吉非替尼聯(lián)用，干預(yù)PC9/GR細(xì)胞48h后，可較單藥吉非替尼導(dǎo)致更高比例的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率從22.29％上升至35.98％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩藥的協(xié)同系數(shù)Q=1.094，表明兩藥在誘導(dǎo)PC9/GR細(xì)胞凋亡上具有相加作用。
　　3.Western Blot法檢測(cè)示2mmol/L二甲雙胍干預(yù)PC9/GR細(xì)胞

9、后，引起AMPK、p-AMPK、mTOR表達(dá)的上調(diào)，p-mTOR表達(dá)的下調(diào)。5μmol/L吉非替尼干預(yù)后，引起AMPK、p-AMPK、mTOR的下調(diào)，p-mTOR的上調(diào)。而兩藥聯(lián)合作用干預(yù)PC9/GR細(xì)胞后，引起AMPK、p-AMPK、mTOR表達(dá)上調(diào)，p-mTOR下調(diào)，其表達(dá)水平較單獨(dú)用藥組有顯著差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　一定濃度范圍內(nèi)，二甲雙胍具有增強(qiáng)PC9/GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性的作用，其機(jī)制可能與二甲