苯并芘通過抑制骨髓間充質(zhì)干細胞自我更新和分化能力影響骨折愈合的研究.pdf

1、背景：在骨折的愈合過程中骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）對骨的再生起了重要作用。香煙中的主要成份苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是芳香烴受體（arylhydrocarbonreceptor,Ahr）的激動劑,可以負性調(diào)控骨量和成骨分化。
　　目的：通過臨床標本、動物模型、體外實驗的研究，分析 BaP對 MSCs分化能力的影響及作用機制，探討B(tài)aP是否會抑制大鼠骨折愈合的進程。

2、
　　方法：本實驗總共分為三個部分1.收集來自吸煙人群的人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow mesenchymal stem,hBMSCs）檢測早期成骨標志物堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性，茜素紅S染色檢測晚期的鈣鹽沉積。檢測芳香烴受體和其靶基因細胞色素P4501B1(cytochrome p4501B1,CYP1B1)的表達情況，驗證長期吸煙人群的hBMSCs的Ahr

3、信號通路是否被激活。
　　用BaP處理C3H10T1/2和原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)，利用MTT和克隆形成實驗檢測MSCs的增殖及自我更新能力,利用油紅O染色，檢測MSCs成脂分化能力，化學發(fā)光和細胞化學染色檢測ALP變化，茜素紅S染色檢測鈣鹽沉積，觀察MSCs的成骨分化能力。Western Blot檢測Ahr信號相關分子的表達情

4、況。為進一步明確其具體機制，采用siAhr干擾Ahr信號通路，檢測siAhr對BaP作用下MSCs成骨分化能力：化學發(fā)光和細胞化學染色檢測ALP變化；茜素紅S染色檢測鈣鹽沉積；Western Blot檢測成骨標志物成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor2,RUNX2），骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）以及SMAD依賴信號通路TGF-β1/SMAD4和非SMAD信號依賴通路TGF-

5、β1/ERK/AKT的表達情況。BaP激活Ahr信號通路的同時采用TGF-β1抑制劑（LY2157299）驗證TGF-β1通路的作用。
　　2.白藜蘆醇作為Ahr的天然抑制劑，與BaP共同作用后分別檢測成骨分化能力和相關信號通路的表達。體內(nèi)實驗，首先構(gòu)建大鼠染毒和骨折模型，Western Blot檢測BM-MSCs的CYP1B1的表達情況，確保染毒模型構(gòu)建成功，X線和 HE檢測骨折愈合情況。用白藜蘆醇與BaP共同作用于大鼠，觀察骨

6、折愈合情況。
　　3.骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）作為成骨誘導因子，與BaP共同作用后檢測成骨分化能力的變化。
　　結(jié)果：吸煙人群的hBMSCs自我更新及成骨分化能力減弱，并且激活Ahr信號通路以及上調(diào)Ahr的靶基因CYP1B1的表達。體外實驗證實，BaP抑制MSCs的自我更新及多向分化能力，主要是通過激活Ahr信號通路抑制SMAD依賴信號通路TGF-β1/SMAD4和非

7、SMAD信號依賴通路TGF-β1/ERK/AKT。白藜蘆醇作為Ahr的天然抑制劑，可以抑制BaP對MSCs的損害。BMP2和BMP9可以抵消BaP抑制成骨分化的作用。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，BaP可以抑制大鼠骨折愈合的進程，并且這個作用會被白藜蘆醇挽救。
　　結(jié)論：
　　1.BaP通過激活Ahr抑制TGF-β1/SMAD4和TGF-β1/ERK/AKT損傷MSCs的干性。白藜蘆醇可以拮抗Ahr抵消BaP的影響。
　　2.Ba