腸易激綜合征腦-腸交互作用模型結(jié)腸5-羥色胺、酪氨酸羥化酶水平變化及蛋白指紋圖譜初探.pdf

1、研究背景：腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種常見(jiàn)的功能性腸病，其病因和發(fā)病機(jī)制并不清楚，目前公認(rèn)IBS是多因素疾病。IBS病理生理學(xué)基礎(chǔ)是腸道動(dòng)力異常和內(nèi)臟高敏感性。單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)是腸神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與腸道感覺(jué)、動(dòng)力、分泌的調(diào)控。 本實(shí)驗(yàn)室前期在腦-腸交互作用理論基礎(chǔ)上，建立了慢急性聯(lián)合應(yīng)激IBS大鼠模型，即動(dòng)物在接受慢性不可預(yù)知輕

2、度應(yīng)激(CUMS)后接受一次急性束縛應(yīng)激，已證實(shí)可從腸道動(dòng)力、感覺(jué)和心理行為多方面模擬IBS表現(xiàn)，且具有穩(wěn)定與重復(fù)性好的特點(diǎn)。本研究在前期對(duì)5-HT與NE在IBS動(dòng)物模型研究的基礎(chǔ)上，將應(yīng)用慢急性聯(lián)合應(yīng)激動(dòng)物模型完善對(duì)5-HT與NE系統(tǒng)的研究并進(jìn)行新的探索研究，整個(gè)研究分為三部分。 研究目的： 1、通過(guò)測(cè)定各組大鼠感覺(jué)傳導(dǎo)通路上脊髓背角、海馬、額葉等腦-腸軸層面神經(jīng)元c-fos水平，從分子水平評(píng)估慢急性聯(lián)合應(yīng)激動(dòng)物模型。

3、 2、完善與深入探討5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)在IBS的變化與可能的作用機(jī)制。 3、利用蛋白質(zhì)組學(xué)觀察IBS腦一腸交互作用動(dòng)物模型結(jié)腸蛋白質(zhì)全景，初步探討IBS這一功能性腸病有無(wú)蛋白水平的變化。 材料與方法： 選用健康雄性成年Wistar大鼠，分為對(duì)照組、急性應(yīng)激組(急性束縛1小時(shí))、慢性應(yīng)激組(CUMS，21天不可預(yù)知輕度應(yīng)激)、慢急性聯(lián)合應(yīng)激組(聯(lián)合應(yīng)激組，CUMS的基礎(chǔ)上給予急性束縛應(yīng)激)。觀察不同應(yīng)激

4、狀態(tài)下的大鼠一定時(shí)間內(nèi)糖水?dāng)z取量、排便顆粒、直腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮次數(shù)的變化，對(duì)模型進(jìn)行再評(píng)價(jià)。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠額葉、海馬、脊髓背角、結(jié)腸c-fos水平；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸嗜鉻細(xì)胞(EC)，甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞(MC)及活化肥大細(xì)胞百分比(活化MC％)；免疫組織雙染方法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸酪氨酸羥化酶(TH)及其活化程度；Western Blot方法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸TH蛋白水平；實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)

5、各組大鼠結(jié)腸和人類(lèi)結(jié)腸粘膜TH-mRNA和c-fos-mRNA水平；MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸蛋白指紋圖譜。 結(jié)果： 1.聯(lián)合應(yīng)激大鼠額葉、海馬、脊髓背角Fos蛋白明顯高于對(duì)照組(P=0.026，0.002，0.013)；結(jié)腸Fos蛋白略高于對(duì)照組(P=0.205)；而與慢性應(yīng)激大鼠相近(P=0.733)。急性應(yīng)激大鼠中樞(額葉、海馬、脊髓背角)與結(jié)腸c-los-mRNA、Fos蛋白與對(duì)照組亦無(wú)顯著差異

6、(P>0.05)。 2、聯(lián)合應(yīng)激可使大鼠結(jié)腸分泌5-HT的EC和MC增多，MC活化脫顆粒，5-HT合成增加(P<0.05)，5-HT含量亦增多，但對(duì)結(jié)腸5-HT代謝的其他指標(biāo)無(wú)顯著影響。急性應(yīng)激組結(jié)腸MC無(wú)明顯變化，而脫顆粒MC％明顯升高，EC較對(duì)照組增多(P>0.05)；慢性應(yīng)激組結(jié)腸EC、MC和脫顆粒MC％增多；結(jié)腸TPH1 mRNA明顯增高，結(jié)腸5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)。 3、聯(lián)合應(yīng)激大鼠結(jié)腸NE含量

7、顯著增高，TH蛋白、TH-mRNA有升高趨勢(shì)(P=0.590，0.363)；急性應(yīng)激組結(jié)腸NE無(wú)明顯變化，TH蛋白、TH-mRNA有增高趨勢(shì)(P>0.05)；慢性應(yīng)激大鼠結(jié)腸NE含量有減低趨勢(shì)，TH蛋白、TH-mRNA無(wú)明顯變化(P>0.05)。 4、結(jié)腸5-HT系統(tǒng)和TH間相關(guān)系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5、腹瀉型IBS患者結(jié)腸粘膜TH和c-fos mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P=0.466，0.110)，便秘型I

8、BS患者結(jié)腸粘膜TH-mRNA低于IBS-D，而與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。 6、聯(lián)合應(yīng)激大鼠與對(duì)照組間有明顯差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量差異峰18個(gè)，與慢性應(yīng)激大鼠間有10個(gè)，與急性應(yīng)激大鼠間有1個(gè)，全部為聯(lián)合應(yīng)激組上調(diào)。各應(yīng)激組之間的差異蛋白有一定重復(fù)性。 結(jié)論： 1、聯(lián)合應(yīng)激大鼠腦一腸軸各層面尤其是脊髓背角、海馬Fos蛋白顯著升高，而單純急性應(yīng)激模型Fos蛋白無(wú)明顯升高，提示慢急性聯(lián)合應(yīng)激模

9、型不同于單純急性束縛應(yīng)激模型，是可以部分模擬腦一腸交互作用的動(dòng)物模型，為從分子水平研究IBS腦一腸交互作用提供平臺(tái)。 2、動(dòng)物與人結(jié)腸標(biāo)本研究顯示：慢性應(yīng)激調(diào)動(dòng)機(jī)體5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)處于活躍狀態(tài)，在此狀態(tài)下，5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)對(duì)新的急性應(yīng)激的反應(yīng)較正常增強(qiáng)， 5-HT和NE總量增多，前者通過(guò)抑制5-HT降解，后者則通過(guò)NE合成增加實(shí)現(xiàn)。在機(jī)體對(duì)慢急性聯(lián)合應(yīng)激的反應(yīng)中，腸道局部以5-HT系統(tǒng)作用為主導(dǎo)，NE系統(tǒng)則起輔助作用