黃芪水提取液對橫紋肌收縮力的影響及其機制研究.pdf

1、[目的]：觀察黃芪水提取液（radix astragali aqueous extract，RAAE）抗氧化活性和對橫紋肌收縮力的影響，并探討其可能的細胞內信號轉導機制。
　　[方法]：實驗對象選用昆明小鼠、Wistar大鼠和H9c2心肌細胞株。
　　1.常溫常壓耐缺氧實驗：將40只昆明小鼠，隨機分成4組，每組10只，即對照組、黃芪水提取液小劑量組、黃芪水提取液中劑量組和黃芪水提取液大劑量組，分別灌胃0.9％NaCl、黃芪水

2、提取液6g/kg、12g/kg和24g/kg，3W后進行耐缺氧時間的測定。
　　2.負重游泳力竭實驗：將30只昆明小鼠，隨機分成3組，每組10只，即對照組、模型組和黃芪水提取液組，依次分別灌胃0.9%NaCl、0.9%NaCl和黃芪水提取液12g/kg，3W后制備肢體缺血/再灌注模型，然后進行負重游泳力竭時間的測定。
　　3.在體骨骼肌收縮力學實驗：取18只Wistar大鼠，隨機分成3組，每組6只，即假手術組、模型組和黃芪水

3、提取液組，依次分別灌胃0.9%NaCl、0.9%NaCl和黃芪水提取液6g/kg，3W后制備骨骼肌缺血/再灌注模型，然后應用電生理學方法，觀察黃芪水提取液對大鼠在體—坐骨神經腓腸肌單收縮（twitch，Te）最大收縮幅度（performance of contration，Pt）和強直收縮（tetanus，Tw）最大收縮幅度（Pt）的影響。
　　4.抗氧化指標測定：進行在體骨骼肌收縮力學指標測定后，采集大鼠血清檢測活性氧簇（rea

4、ctive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA），取腓腸肌和心肌組織檢測SOD活性、MDA含量。
　　5.離體骨骼肌收縮力學實驗：Wistar大鼠，分離腓腸肌制備離體灌流模型，隨機分為3組，每組6例，即對照組、模型組和黃芪甲苷（astragaloside IV）組，分別在灌流液中加入0.9%NaCl或黃芪甲苷50

5、μM，觀察黃芪甲苷對腓腸肌單收縮最大收縮幅度和強直收縮最大收縮幅度的影響。離體骨骼肌收縮力學指標測定后，取腓腸肌標本電鏡下觀察腓腸肌超微結構的改變。
　　6.離體心臟灌流心功能實驗：Wistar大鼠，制備大鼠離體心臟灌流模型，隨機分為對照組和黃芪組，分別在灌流液中加入0.9%NaCl或黃芪甲苷50μM，觀察觀察黃芪甲苷對心臟左室發(fā)展壓（leftventricular-developed pressure，LVDP）和冠脈流量（co

6、ronary flow，CF）的影響。離體心臟功能測定后，取心肌標本電鏡下觀察心肌超微結構的改變。
　　7.黃芪甲苷的抗氧化活性作用細胞內信號轉導途徑：
　?、貶9c2細胞氧化損傷模型：用H2O2（500μM）造成H9c2細胞線粒體氧化應激損傷，采用線粒體特異性熒光染料四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester，TMRE）進行染色，通過激光掃描共聚焦顯微鏡成像法測定H9c2細胞線粒體膜電位（mito

7、chondrial membrane potential,Ψm）的變化，以判斷線粒體膜通透性轉移孔（mitochondrial-permeability transition pore，mPTP）的開放程度，進而確定線粒體的損傷程度。
　　②黃芪甲苷對GSK-3β及Akt磷酸化的影響：給予不同濃度的黃芪甲苷處置培養(yǎng)的H9c2細胞10min20分鐘后，用Western blot法檢測黃芪甲苷對H9c2細胞GSK-3β（Ser9）、A

8、kt磷酸化的影響及給予PI3K抑制劑LY294002(LY,10μM)后對GSK-3β（Ser9）磷酸化的影響。
　?、埸S芪甲苷對mPTP開放的影響：給予不同濃度的黃芪甲苷處置培養(yǎng)的H9c2細胞20min后，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察對TMRE紅色熒光強度的影響，即黃芪甲苷能否阻止氧化應激引起的mPTP開放；觀察給予PI3K抑制劑LY294002(LY,10μM)10min后，再處置黃芪甲苷20min時TMRE紅色熒光強度的改變。

9、
　?、茳S芪甲苷抑制mPTP開放的機制：cGMP抑制劑ODQ(5μM)和PKG抑制劑KT5823(1μM)處置10min后，給予黃芪甲苷處置20min，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察對TMRE紅色熒光強度的影響；cGMP抑制劑ODQ(1H-[1,2,4]惡二唑[4,3-a]喹喔啉-1-酮，oxadiazole quinoxalin，5μM)和PKG抑制劑KT5823(1μM)處置10min后，給予黃芪甲苷處置20min，用Wester

10、n blot法檢測對H9c2細胞GSK-3β（Ser9）、血管擴張刺激磷蛋白（Vasodilator stimulated phosphoprotion,VASP）磷酸化的影響。⑤黃芪甲苷對NO生成的影響：采用DAF-FM(3-Amino，4-aminomethyl-2'，7'-difluorescein，diacetate)進行熒光染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察黃芪甲苷對H9c2細胞內一氧化氮（nitric oxide，NO）生成的影響

11、。
　　[結果]：
　　1.黃芪水提取液對小鼠耐缺氧時間的影響：灌胃3W后，黃芪水提取液中、大劑量組與對照組比較，小鼠的耐缺氧時間明顯增加(P＜0.05)；黃芪水提取液小劑量組與對照組比較，小鼠的耐缺氧時間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　2.黃芪水提取液對小鼠骨負重游泳力竭時間的影響：在灌胃3W后，黃芪水提取液組的小鼠負重游泳時間比模型組顯著延長（P＜0.05），模型組比對照組顯著縮短（P＜0.05），有統(tǒng)計學意義

12、。
　　3.黃芪水提取液對大鼠在體骨骼肌收縮力的影響：黃芪水提取液組的單收縮的最大收縮幅度和強直收縮的最大收縮幅度顯著增強，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.黃芪水提取液對大鼠血清ROS、SOD、MDA和腓腸肌、心肌組織中SOD、MDA含量的影響：黃芪水提取液組大鼠的血清中ROS活性減弱、SOD活性增強、MDA含量降低（均P＜0.05），腓腸肌和心肌組織中SOD活性顯著增強、MDA含量明顯降低，與模型組比較

13、差異顯著（均P＜0.05）。
　　5.黃芪甲苷對離體骨骼肌缺氧模型腓腸肌收縮力學指標的影響：黃芪甲苷組的單收縮的最大收縮幅度（Pt）和強直收縮的最大收縮幅度（Pt）顯著增強，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.黃芪甲苷對離體心臟缺血/再灌注損傷模型心功能的影響：黃芪甲苷組的冠脈流量（coronary flow，CF）、左心室發(fā)展壓（left ventricular-developed pressure，LVD

14、P）明顯高于對照組（均*P＜0.05）。
　　7.電鏡下觀察腓腸肌和心肌超微結構的改變：缺血缺氧損傷造成了腓腸肌組織和心肌組織的線粒體損傷，而給予黃芪甲苷處置的則線粒體損傷明顯減輕。
　　8.黃芪甲苷的抗氧化活性作用細胞內信號轉導途徑：
　?、冱S芪甲苷對GSK-3β及Akt磷酸化的影響：在給予不同濃度的黃芪甲苷處置培養(yǎng)的H9c2細胞10min20分鐘后，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷30μM、50μM、80μM的藥物濃度均能增加磷酸化的

15、GSK-3β表達，與對照組比較差異顯著（*P＜0.05）。黃芪甲苷增加GSK-3β磷酸化的作用可被抑制劑LY294002所抑制，同時黃芪甲苷可明顯增加Akt(Ser473)的磷酸化，說明PI3K/Akt信號通路參與黃芪甲苷對GSK-3β的作用。
　　②黃芪甲苷對mPTP開放的影響：與對照組相比，50~80μM的黃芪甲苷能夠顯著抑制TMRE紅色熒光強度的減弱（P＜0.05），即黃芪甲苷能夠阻止氧化應激引起的mPTP開放。這種作用被P

16、I3K抑制劑LY294002所阻斷。
　?、埸S芪甲苷抑制mPTP開放的機制：黃芪甲苷阻止TMRE熒光強度減弱的作用，可被cGMP抑制劑ODQ和PKG抑制劑KT5823所抑制（P＜0.05），提示 cGMP/PKG信號通路參與了黃芪甲苷的抗氧化應激損傷的保護作用。此外，Western blot結果顯示，黃芪甲苷增加GSK-3β磷酸化的作用被ODQ和KT5823所抑制，同時黃芪甲苷能夠明顯增加VASP的磷酸化，進一步說明cGMP/PK

17、G作為GSK-3β的上游信號參與黃芪甲苷的心肌保護作用。
　?、茳S芪甲苷對NO生成的影響：通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，與對照組相比，黃芪甲苷明顯增強H9c2細胞DAF-FM的綠色熒光強度，此作用可被NOS抑制劑L-Name(200μM)和PI3K抑制劑LY294002(LY,10μM)所阻斷，提示黃芪甲苷通過NOS調節(jié)NO的產生，且這種作用可能與PI3K/Akt信號通路有關。
　　[結論]：
　　1.黃芪水提取液具有