冬青苦丁茶多酚和多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)與抗氧化活性研究.pdf

1、苦丁茶是一種純天然植物代用茶,富含三萜及其皂苷類、黃酮、氨基酸等活性物質(zhì),具有抗氧化、降脂、抗炎殺菌、減肥、降血壓等多種藥理功能。在我國,主要的苦丁茶是利用冬青科樹葉加工而成的苦丁茶和利用木犀科樹葉加工而成的苦丁茶,而前者主要有苦丁茶冬青和大葉冬青。近年來,已有人對冬青苦丁茶的化學成分和藥理作用作了一些研究,但研究多集中在粗提物藥理作用及其機制的研究上,化學成分研究僅限于三萜及其皂苷類、黃酮類的研究。因此,本研究以苦丁茶冬青苦丁茶和大葉

2、冬青苦丁茶(兩者通稱為冬青苦丁茶)為原料,較為系統(tǒng)地研究其多酚類物質(zhì)的測定方法、提取、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和抗氧化活性,同時采取熱水提取與醇沉制備冬青苦丁茶多糖,利用層析技術(shù)對其進行分離純化,并對冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分的基本理化性質(zhì)、體外抗氧化活性進行分析。
　　 1.冬青苦丁茶多酚含量的測定及其抗氧化活性
　　 以綠原酸為標準品,建立了測定冬青苦丁茶中多酚含量的Folin-Ciocalteu比色法。結(jié)果表明,苦丁茶提取

3、液在Folin-Ciocalteu試劑3.0ml、飽和Na2CO3溶液4.5ml、反應(yīng)溫度30℃、反應(yīng)時間30 min的條件下,測定其747 nm處的吸光值,多酚濃度在20.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系；穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性和回收率實驗的相對標準偏差為0.887～1.416％；與酒石酸亞鐵比色法的測定結(jié)果無顯著差異。
　　 苦丁茶冬青苦丁茶熱水提取物(粗提物)經(jīng)不同的有機溶劑分部萃取,得到氯仿萃取物、

4、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取剩余物,然后采用Folin-Ciocalteu比色法測定粗提物和各萃取物的多酚含量,同時應(yīng)用DPPH法、TEAC法和FRAP法分別測定粗提物和各萃取物的自由基清除能力和還原Fe3+能力。結(jié)果表明,苦丁茶提取物具有較高的多酚含量和較強的抗氧化能力,DPPH法和FRAP法測定各提取物抗氧化能力的結(jié)果為乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>粗提物>萃取剩余物>氯仿萃取物,TEAC法測定結(jié)果為乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取

5、物>粗提物>氯仿萃取物>萃取剩余物；多酚含量與抗氧化能力之間、所用抗氧化測定方法之間均存在較好的相關(guān)性。
　　 比較了苦丁茶冬青苦丁茶和大葉冬青苦丁茶提取液中多酚、黃酮的含量及體外抗氧化能力,結(jié)果表明多酚含量較高的苦丁茶冬青苦丁茶比黃酮含量高的大葉冬青苦丁茶具有較高的體外抗氧化能力。對五種體外抗氧化活性評價方法之間的相關(guān)性進行了分析,結(jié)果表明各抗氧化方法間相關(guān)性良好(R>0.8478),尤以DPPH法與ABTS法的相關(guān)性最高(R

6、0.9967)。
　　 2.冬青苦丁茶多酚提取條件的優(yōu)化
　　 提取溶劑甲醇、乙醇和水對苦丁茶多酚的提取有顯著的影響,提取物的多酚含量隨提取溶劑的不同而不同,甲醇、乙醇和水三者之間提取物多酚含量差異顯著(P<0.05),這三者中乙醇的提取效果最好。
　　 選擇乙醇濃度、提取溫度和提取時間3個因素分別進行實驗,比較提取物的多酚含量,確定了各因素在CCD實驗中的取值中心點,即乙醇濃度、提取溫度和提取時間分別是70％、

7、70℃和60 min。在單因素實驗基礎(chǔ)上,以提取物的多酚含量和清除DPPH自由基能力IC50值為響應(yīng)值,利用Design-Expert軟件對乙醇濃度、提取溫度及提取時間3個參數(shù)進行三因素三水平的CCD實驗,對3個參數(shù)的實驗組合進行優(yōu)化。獲得的最優(yōu)提取條件為:乙醇濃度70.5％、提取溫度73.9℃和提取時間61.2 min的條件下可以得到最高的多酚含量(235.24 mg CHA/gDW)；乙醇濃度70.2％、提取溫度70.6℃和提取時間

8、60.4 min時可以獲得最大的DPPH自由基清除能力(IC50,480.87μg/mL)?？梢钥闯?兩組優(yōu)化條件基本一致,說明可以用相同的提取條件獲得最優(yōu)的多酚含量和抗氧化能力的苦丁茶提取物。
　　 用水為提取溶劑時,提取溫度和提取時間2個因素對苦丁茶多酚的提取有顯著的影響。通過實驗優(yōu)化,得到了苦丁茶多酚的最優(yōu)提取條件為:提取溫度91.2℃和時間36.1 min,提取物總酚含量達198.45 mg CHA/gDW；提取溫度92

9、.2℃和35.7 min,提取物清除DPPH自由基能力最強(IC50,744.74μg/mL)。同樣,兩組優(yōu)化條件基本一致,說明以水為提取溶劑時可以用相同的提取條件獲得最優(yōu)的總多酚含量和抗氧化能力的苦丁茶提取物。
　　 選用5次優(yōu)化的提取條件和5次隨機設(shè)定的提取條件,對模型方程的適用性進行驗證。結(jié)果表明,驗證性實驗的實驗值與模型方程的預(yù)測值間存在很好的一致性,說明優(yōu)化出的提取條件是切實可行的。
　　 3.苦丁茶冬青苦丁茶

10、中多酚的分離純化與結(jié)構(gòu)解析
　　 利用HPLC-DAD分析了冬青苦丁茶、女貞苦丁茶與綠茶(雨花茶)的多酚類化合物組成,結(jié)果表明它們的色譜峰圖呈現(xiàn)明顯的不一致,這說明苦丁茶的主要化學成分可能不同于綠茶,苦丁茶冬青苦丁茶和女貞苦丁茶的組成可能也不一樣。
　　 通過HPLC-MS和HPLC-DAD分析,結(jié)合茶葉兒茶素[(-)-EC、(-)-ECG、(-)-EGC和(-)-EGCG]、沒食子酸、咖啡堿、茶葉堿和可可堿的標準樣疊加

11、分析驗證,綠茶的主要多酚類成分為沒食子酸、沒食子?；崴帷C、(-)-EGC、(-)-EGCG和(-)-ECG。根據(jù)苦丁茶冬青苦丁茶的HPLC-MS分析結(jié)果與相關(guān)參考文獻,推測其主要多酚類化合物為綠原酸及其衍生物,即3-咖啡酰基奎尼酸、綠原酸、4-咖啡?；崴帷?,4-二咖啡?；崴帷?,5-二咖啡?；崴岷?,5-二咖啡?；崴帷６鶕?jù)女貞苦丁茶的HPLC-MS分析結(jié)果,認為女貞苦丁茶的主要酚類化合物為苯乙醇苷類成分,即紫

12、莖女貞苷 A、Ligurobustoside N、紫莖女貞苷 C、紫莖女貞苷B和Osmanthuside B6。
　　 利用半制備型HPLC從苦丁茶冬青苦丁茶中分離純化得到5種單體化合物,通過MS和NMR分析結(jié)合HPLC-DAD、HPLC-MS的分析結(jié)果,將5種單體化合物分別鑒定為羥基酪醇葡萄糖苷(hydroxytyrosol glucoside)、綠原酸、4,5-O-二咖啡?？崴帷?,5-O-二咖啡?？崴岷?,4-O-二咖

13、啡?？崴?其中化合物1是首次從苦丁茶冬青苦丁茶中分離得到。
　　 4.大葉冬青苦丁茶多糖提取、純化與抗氧化活性
　　 大葉冬青苦丁茶經(jīng)熱水提取、脫色、醇沉、干燥,得到大葉冬青苦丁茶粗多糖(ILPS)。粗ILPS經(jīng) DEAE-52纖維素層析柱分離得到四個多糖組分,即ILPS-1、ILPS-2、ILPS-3和ILPS-4。紅外光譜分析表明粗ILPS及其純化組分均是多糖類物質(zhì),粗ILPS與各純化組分的蛋白質(zhì)、糖醛酸和硫酸基含