NF-κB信號通路介導的TNF-α抑制骨髓基質(zhì)細胞成骨分化過程中的作用研究.pdf

1、牙周病是口腔兩大常見病多發(fā)病之一，是導致牙齒缺失的重要原因。它是以牙周袋形成和牙槽骨吸收為特點的細菌感染性炎性疾病，其特征是牙周支持組織（牙槽骨，牙骨質(zhì)和牙周韌帶）的炎癥和破壞。牙周病治療的最終目的是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復牙周組織的結構和功能，要求有新的牙槽骨和牙骨質(zhì)及插入其中的膠原纖維的形成，即真正意義上的再生。而真正意義上的牙周再生應該是對發(fā)育過程中胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生的重演，其中干細胞的增殖與分化是決定牙周再生成功與否

2、的關鍵因素。干細胞是一類具有自我更新和分化的潛能的細胞，其增殖和分化受多種內(nèi)在機制和微環(huán)境因素影響?？谇皇莻€細菌污染環(huán)境，而牙周病更是細菌感染性疾病，在牙周再生過程中，干細胞處于炎性微環(huán)境當中，其增殖和分化的調(diào)控很可能受到炎性因子的影響，現(xiàn)有大多數(shù)研究以成骨細胞系為研究對象，證實炎性因子能夠影響成骨細胞特異性基因的表達、細胞基質(zhì)的分泌以及成骨細胞的凋亡，但沒有說明在干細胞向成骨細胞分化過程中炎性信號通路對成骨基因表達的調(diào)控作用。因此，在

3、牙周病的病理和修復過程中，慢性、長期、高濃度的炎性微環(huán)境對于成體干細胞向成骨細胞分化影響機制的研究，將有助于我們了解炎癥刺激下的成體干細胞的生物學特性，據(jù)此為臨床研發(fā)新的更有效的牙周治療方法開辟新的思路。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核生物中，是一個由復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。它作為信號傳導途徑中的樞紐，與免疫、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細胞凋亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB

4、在細胞因子誘導的基因表達中起關鍵性的調(diào)控作用，它調(diào)控的基因編碼急性期反應蛋白、細胞因子、細胞粘附分子、免疫調(diào)節(jié)分子、病毒瘤基因、生長因子、轉(zhuǎn)錄和生長調(diào)控因子等。通過調(diào)控多種基因的表達，NF-κB參與免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生、成骨分化等多種生物進程。有活性的DNA結合的經(jīng)典NF-κB信號是一個二聚體（p50和p65的二聚體），靜息狀態(tài)下，NF-κB以無活性的潛在狀態(tài)存在于細胞漿中，它與一種抑制因子IκB結合組成一個三聚體p5

5、0-p65-IκB。當細胞受到TNF、IL-1等炎性因子刺激時，IκB即從三聚體中解離出來，暴露出p50亞基上的易位信號和p65亞基上的DNA結合位點，從而使此異二聚物表現(xiàn)出NF-κB活性，并從細胞質(zhì)中易位到細胞核中，與κB基序(κBmotif)相結合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在炎癥的牙周微環(huán)境中，NF-κB在炎性因子的作用下，通過復雜的機制，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，調(diào)控著各種上下游成骨基因的表達。
　　 近年來，有研究者提出NF-κ

6、B與BMP2和Runx2這兩種成骨誘導因子存在相關性。骨形成蛋白BMP2不僅在體內(nèi)可以引起骨的形成，而且在體外能引起間充質(zhì)細胞的成骨分化，然而BMP2尚不能滿足牙周病治療中骨再生的臨床應用，可能的原因是炎癥因子抑制了骨再生和其誘導的成骨分化，目前絕大多數(shù)研究者認為TNF-α可通過NF-κB信號通路促進BMP2的表達，而BMP2可通過激活Smad途徑，促進下游成骨效應分子表達。但也有研究表明TNF-α通過NF-κB信號通路抑制了成骨分化。

7、這其中的確切機制的明確將有助于在炎癥狀態(tài)下骨缺損修復中成骨分化的誘導。
　　 在成骨分化的眾多調(diào)控因子當中，Runx2被認為是成骨細胞分化的主控基因(mastergene)，在Runx2基因敲除的小鼠中成熟的成骨細胞和骨化完全缺失，僅能觀察到一些只微弱表達ALP活性而不表達骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和骨鈣素(osteocalcin，OC)的不成熟成骨細胞。有證據(jù)顯示TNF-α可以通過抑制Runx2而抑制前成骨細胞

8、的分化，雖然確切機制尚有爭議，但提示炎性因子有可能通過NF-κB信號途徑在Runx2與其下游效應分子之間起到調(diào)控作用。
　　 因此，本研究以小鼠骨髓基質(zhì)干細胞ST2為研究對象，分別過表達了NF-κB的兩個不同亞基p50/p65，以及過表達IκB以阻斷NF-κB信號通路。在體外經(jīng)礦化誘導，觀察過表達NF-κB是否重演了炎性因子對成骨分化的影響，阻斷NF-κB是否消除了炎性因子對各成骨信號通路的影響。施加炎癥刺激和成骨誘導，利用Du

9、al-Luciferase雙熒光素酶檢測BMP-Smad信號通路、Runx2-BSP、Runx2-OSE信號通路是否由TNF-α通過NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)。
　　 材料和方法：
　　 1.TNF-α對成骨誘導ST2細胞成骨基因表達的影響，及其對BMP2和Runx2促成骨作用的調(diào)控
　　 復蘇凍存的ST2細胞，經(jīng)傳代后達到良好細胞狀態(tài)后，分別施以成骨誘導液，TNF-α或/和BMP2;TNF-α或/和過表達Runx

10、2質(zhì)粒;誘導一定時間段后提取總RNA或/和總蛋白，采用RT-PCR和Westernblot法觀察各成骨基因在ST2細胞中的表達，檢測TNF-α對ST2細胞成骨基因表達的影響及是否調(diào)控BMP2和Runx2對下游成骨基因的促進作用。
　　 2.TNF-α及其下游NF-κB信號通路對BMP2-Smad信號通路的影響。
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p65、p50、IκB、及其相應對照空載體到ST2細胞中，成骨誘導，TNF-α和/或BMP2作用

11、后，在一定時間點收集細胞并提取總RNA，用RT-PCR法檢測目的成骨基因的變化;瞬時共轉(zhuǎn)染帶有Smad結合元件啟動子的SBE-luc和Renia熒光素酶到相應細胞中，TNF-α和/或BMP2作用后，檢測熒光報告基因表達，判斷BMP2對下游基因的轉(zhuǎn)錄控制是否被炎性因子TNF-α或NF-κB信號通路的阻斷而影響。
　　 3.TNF-α對Runx2-BSP和Runx2-OSE信號通路的抑制是通過NF-κB信號通路實現(xiàn)的
　　

12、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p65、p50、IκB、及其相應對照空載體到ST2細胞中，再共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Runx2和帶有BSP(或OSE)啟動子的熒光報告基因和海腎熒光素酶到相應細胞中，施以TNF-α刺激，以不加TNF-α作對照，檢測熒光值。比較TNF-α對Runx2-BSP和Runx2-OSE信號通路的抑制是否通過NF-κB信號通路實現(xiàn)。
　　 結果：
　　 1、TNF-α對ST2細胞成骨分化中BMP2和Runx2基因表達水平及其促成骨功能的影

13、響
　　 作為未成熟的前成骨細胞，ST2細胞的成骨基因的表達有時空特點，其中BMP2、Runx2屬于上游基因，礦化誘導早期就能高表達，OC，BSP屬于下游基因。在礦化誘導的ST2細胞中，TNF-α提高了BMP2的表達，抑制Runx2，OC，BSP的表達，可不同程度地逆轉(zhuǎn)BMP2和Runx2上調(diào)其下游靶基因OC，BSP表達水平的作用。
　　 2、TNF-a通過NF-κB信號通路促進BMP2的表達，但對BMP2-Smad信號

14、通路無影響
　　 成骨誘導的阻斷NF-κB信號通路的ST2細胞中，TNF-α對BMP2表達的促進作用被消除;但不影響B(tài)MP2對下游基因的調(diào)控，對BMP-Smad信號通路無影響。成骨誘導的過表達NF-κB信號通路的ST2細胞中，BMP2表達水平顯著提高，再加入外源性BMP2之后，下游基因OC，BSP的表達有所提高，但不如對照組提高的幅度大;對BMP-Smad信號通路亦無影響。
　　 3、TNF-α通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)

15、Runx2-BSP通路，但對Runx2-OSE啟動子信號通路無影響
　　 在ST2細胞內(nèi)過表達p50或p65可在ST2細胞成骨分化過程中降低Runx2的表達水平;過表達IκBα阻斷NF-κB信號通路后，TNF-α抑制Runx2表達的作用被拮抗。在ST2細胞內(nèi)過表達p50或p65可抑制Runx2對9.0kbBSP啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用;TNF-α可抑制Runx2對9.0kbBSP啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用，而通過過表達IκBα阻斷NF-κ

16、B信號通路后，TNF-α的這一抑制作用被消除。TNF-α和NF-κB信號通路均不影響Runx2對OSE2的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　 結論：
　　 1.TNF-α上調(diào)了BMP2的mRNA表達，但其對BMP2促成骨功能的逆轉(zhuǎn)或抑制最終掩蓋了BMP2的促成骨作用，從而使得TNF-α，尤其是高濃度的TNF-α，對骨髓基質(zhì)細胞的成骨分化的最終作用主要表現(xiàn)為抑制。
　　 2.在骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化過程中，TNF-α及其激活的

17、NF-κB信號通路雖然能夠上調(diào)BMP2基因的表達水平，但是TNF-α顯著抑制BMP2下游成骨效應蛋白的表達水平。這一抑制作用不是通過以GTCTAGACSmad結合序列為特征的BMP2-Smad信號通路完成的。
　　 3.在骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化過程中，TNF-α及其激活的NF-κB信號通路抑制了Runx2基因的表達水平，同時通過NF-κB信號通路抑制了Runx2激活的BSP啟動子的轉(zhuǎn)錄，但是并不影響Runx2激活的OSE2啟動