KLF15過表達(dá)抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖.pdf

1、目的:
　　 為探討可能的新的系膜增殖抑制因子KLF15對(duì)系膜細(xì)胞增殖的作用,我們利用電轉(zhuǎn)染大鼠KLF15基因真核表達(dá)質(zhì)粒的方法使體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子KLF15,隨后應(yīng)用一系列方法檢測(cè)過表達(dá)KLF15對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 1)利用真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1合成帶有大鼠KLF15基因的質(zhì)粒pcDNA3.1-KLF15,并應(yīng)用酶切和測(cè)序等方法鑒定。將合成的質(zhì)粒及其空載體質(zhì)

2、粒通過轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)等方法使其大量擴(kuò)增并提?。?)大鼠腎小球系膜細(xì)胞于10％FCS1640培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng),將兩種質(zhì)粒通過電穿孔的方法導(dǎo)入系膜細(xì)胞,系膜細(xì)胞分為以下三組:①對(duì)照組(10％FCS1640組,簡(jiǎn)稱為control組)；②空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(10％FCS1640+pcDNA3.1組,簡(jiǎn)稱為pcDNA3.1組)；③KLF15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(10％FCS1640+pcDNA3.1-KLF15組,簡(jiǎn)稱為pcDNA3.1-KLF15組),轉(zhuǎn)

3、染后48小時(shí)提取細(xì)胞總RNA及總蛋白,RT-PCR及Western blotting分別檢測(cè)KLF15 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平；3)MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀分析3組細(xì)胞周期的變化；4)Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinD1、cyclinE、CDK2、p27)的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1)經(jīng)鑒定合成的質(zhì)粒為正確的攜帶大鼠KLF15基因的質(zhì)粒；2)與對(duì)照組和pc

4、DNA3.1組相比,pcDNA3.1-KLF15組KLF15 mRNA及蛋白質(zhì)明顯高表達(dá)(P<0.05)；3)KLF15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可顯著抑制系膜細(xì)胞的增殖水平,細(xì)胞培養(yǎng)24、48小時(shí)MTT吸光度均明顯降低(P<0.05),細(xì)胞周期分析顯示pcDNA3.1-KLF15組S期細(xì)胞顯著減少,增殖指數(shù)顯著降低(P<0.05)；4)KLF15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可使細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1、cyclin E、CDK2表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),負(fù)