表達(dá)β-內(nèi)啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)治療大鼠骨癌痛的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性疼痛是目前最常見也是最缺乏有效治療手段的疾病。對于那些晚期癌痛患者,疼痛往往成為他們生命最后階段最為痛苦的經(jīng)歷。有研究顯示約有三分之二的晚期癌痛患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,骨轉(zhuǎn)移也被認(rèn)為是癌癥引起疼痛最為常見的原因,腫瘤細(xì)胞的不斷浸潤,正常的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,其結(jié)果是受侵犯骨在輕度受力的情況下即會出現(xiàn)劇烈的疼痛反應(yīng),這是影響晚期腫瘤患者生存質(zhì)量的主要原因之一。有效的止痛治療已成為目前亟待解決的問題。靜脈或口服阿片類

2、藥物是緩解疼痛的有效方法,但又帶來諸多副作用,如過度鎮(zhèn)靜、呼吸抑制、便秘以及成癮等。病人自控鎮(zhèn)痛技術(shù)的出現(xiàn),給癌痛患者帶來了福音,但同樣存在難以長期維持、增加感染機(jī)會、費用較高等問題。尋找更方便、有效、作用持久且經(jīng)濟(jì)、安全的鎮(zhèn)痛方法,成為人們關(guān)注的熱點。近年來,用基因治療的方法來處理慢性疼痛,利用外源性載體介導(dǎo)內(nèi)源性蛋白直接或間接作用于外周和中樞神經(jīng)元,有著比化學(xué)藥物或蛋白制劑純度高、副作用少、耐受發(fā)生率低,且可利用載體表達(dá)的特異性和長

3、期性等優(yōu)勢,解決了臨床上長期用藥帶來的問題。
　　目前,有研究表明使用表達(dá)β-內(nèi)啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)對CCI大鼠模型的疼痛治療有著積極的意義。那么,如果使用Ad-NEP對骨癌痛大鼠進(jìn)行疼痛治療,是否也有積極的效果呢?本實驗擬構(gòu)建攜帶β-內(nèi)啡肽的重組腺病毒,并通過側(cè)腦室注射接種,轉(zhuǎn)染宿主室管膜細(xì)胞,長期高效地表達(dá)β-內(nèi)啡肽,升高腦脊液中β-內(nèi)啡肽的含量,經(jīng)由腦脊液循環(huán)直接作用于脊髓節(jié)段μ型阿片受體(MOR)。通過 G蛋白

4、介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路抑制神經(jīng)元從c-fos和 c-jun基因的表達(dá),從而抑制傷害性信號的上傳,增強(qiáng)抑制性調(diào)制系統(tǒng)的功能,改變神經(jīng)元的可塑性來提高痛閾。本研究試圖嘗試慢性癌痛病人的長期治療的新途徑,為進(jìn)一步研究腺病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率及其安全性提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.大鼠脛骨癌痛模型的建立和可行性評估
　　將實驗大鼠分為腫瘤組,假手術(shù)組,和正常組三組。預(yù)先將Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞接種于剛斷奶的

5、幼鼠腹腔中,于種植的第7天抽取幼鼠含有腫瘤細(xì)胞的腹水,分離提取,而后將此腹水混合液注入腫瘤組實驗大鼠右側(cè)脛骨。假手術(shù)組注入滅活的腹水混合液,正常組大鼠不做處理。接種術(shù)后當(dāng)天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天,每天同樣的時間點,將三組實驗大鼠進(jìn)行大鼠正常走動痛行為學(xué)評分(The score of ambulatory pain),輻射熱刺激測痛以及機(jī)械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學(xué)測定。各組大鼠于接種后

6、第22天,于麻醉后,對其雙下肢進(jìn)行CT掃描。CT掃描條件:80KV,50MA,矩陣512×512,層厚0.7mm。觀察右側(cè)脛骨骨質(zhì)有無發(fā)生變化。以上實驗遵從隨機(jī)雙盲原則。
　　2.大鼠側(cè)腦室注射表達(dá)β-內(nèi)啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)對腦脊液β-內(nèi)啡肽濃度的影響。
　　我們使用病毒滴度為5×1011PFU的非增殖型第一代基因重組腺病毒 Ad-NEP,分別制備5×1010PFU、5×109PFU、5×108PFU、5×107

7、PFU四種不同滴度容積為30ml的待用病毒溶液。將實驗SD大鼠分為6組,其中A組,B組,C組,D組,E組分別對應(yīng)5×107PFU,5×108PFU,5×109PFU,5×1010PFU,5×1011PFU五種不同滴度的Ad-NEP,F組為生理鹽水對照組。對應(yīng)組別將五種不同滴度的Ad-NEP分別注入相應(yīng)組別健康正常大鼠側(cè)腦室,在注射后第4天采集大鼠腦脊液并測定其中β-EP濃度。同時,F組于對應(yīng)時間注射生理鹽水進(jìn)行對照。統(tǒng)計分析各個不同濃度

8、組以及正常對照組的大鼠腦脊液β-EP濃度值,將病毒滴度對數(shù)值與腦脊液β-EP濃度值作相關(guān)性分析,推定適合大鼠側(cè)腦室注射的病毒滴度并討論表達(dá)物與所注射病毒滴度的相關(guān)性。
　　3.腺病毒Ad-NEP側(cè)腦室注射后對于骨癌痛大鼠疼痛的影響。
　　根據(jù)第二部分實驗結(jié)果制備滴度為5×109 PFU的Ad-NEP。根據(jù)第一部分實驗結(jié)果使用 walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞建立大鼠脛骨癌痛模型。實驗大鼠隨機(jī)分為Ad-NEP組(A組),對照組

9、(B組)和正常組(C組)。前兩組實驗動物均按照第一部分實驗方法復(fù)制大鼠脛骨癌痛模型。而后在接種第10天Ad-NEP組大鼠側(cè)腦室注射5×109 PFU的Ad-NEP,對照組注射等容量的生理鹽水。正常組大鼠不做任何處理。同時在接種含有腫瘤細(xì)胞的腹水手術(shù)后的當(dāng)天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天,每天同樣的時間點,將三組實驗大鼠進(jìn)行測量體重,正常走動痛行為學(xué)評分(The score of ambulatory pai

10、n),輻射熱刺激測痛以及機(jī)械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學(xué)測定。此外,以側(cè)腦室注射日為0天,在側(cè)腦室注射Ad-NEP后的第2,4,8,12天,分別在當(dāng)日行為學(xué)評估之后進(jìn)行三組實驗大鼠腦脊液的抽取,并使用放射免疫分析法(Radial Immunoassay,RIA)測定腦脊液標(biāo)本中b-EP濃度。Ad-NEP組實驗大鼠于接種后22天也就是側(cè)腦室注射后第12天,在進(jìn)行行為學(xué)測定以及腦脊液抽取后進(jìn)行腦組織的取材。取材之后標(biāo)本進(jìn)行切片,

11、并熒光染色。以上實驗遵從隨機(jī)雙盲原則。
　　結(jié)果：
　　1.腫瘤組有兩只大鼠在術(shù)后第7天出現(xiàn)不可預(yù)見的死亡。假手術(shù)組自術(shù)后第二天其飲水進(jìn)食均正常,無出現(xiàn)死亡。在手術(shù)第1周,腫瘤組的體重和其他兩組無明顯區(qū)別,第2周開始腫瘤組體重增長慢于其他兩組,到第3周差距更加明顯。術(shù)后第6天始,腫瘤組15只大鼠中2只評分為3分。術(shù)后第18天,腫瘤組所有大鼠正常走動痛行為學(xué)評分均為1分。假手術(shù)組和正常組大鼠術(shù)后第2天開始觀察,步態(tài)正常,評分均

12、為4分。對于大鼠輻射熱刺激測痛的行為學(xué)評估,通過測試,我們發(fā)現(xiàn)各組熱痛覺過敏潛伏期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。對于大鼠機(jī)械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學(xué)測定,測試發(fā)現(xiàn)腫瘤組在行走痛行為學(xué)評分較高的早期,接種側(cè)后肢和對側(cè)后肢相比無統(tǒng)計學(xué)改變,但當(dāng)出現(xiàn)患側(cè)后足明顯不負(fù)重時,此時會出現(xiàn)2-3天的機(jī)械痛超敏期。同一只大鼠在接種后的早期,測得一穩(wěn)定的和基礎(chǔ)值相近的痛閾值。當(dāng)出現(xiàn)痛敏時,同樣條件測到的痛閾值和前者有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

13、除此以外,機(jī)械性誘發(fā)痛覺超敏時期患側(cè)和對側(cè)的痛閾值也有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。大鼠影像學(xué)結(jié)果,接種手術(shù)后第22天,腫瘤組有兩只大鼠CT掃面見腫瘤并未侵蝕右側(cè)脛骨,后行解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤侵蝕右側(cè)脛骨外組織直至皮下。其余腫瘤組大鼠CT掃面均可見右側(cè)脛骨上段干骺端骨皮質(zhì)變薄,蟲蝕狀改變,透光性增加。假手術(shù)組及正常組均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤侵蝕。
　　2. E組實驗大鼠在側(cè)腦室注射后陸續(xù)全部死亡。其余4個實驗組無實驗大鼠死亡,并且這4個實驗組組

14、間數(shù)據(jù)均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P﹤0.01)。其中A、B組與正常對照組(F組)數(shù)據(jù)無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);C、D組與正常對照組(F組)相比均有顯著差異(P﹤0.01)。
　　3.各組大鼠接種手術(shù)一周內(nèi)的體重?zé)o明顯區(qū)別,但從第二周開始A組B組體重增長慢于C組,到第三周,其差距更加明顯,側(cè)腦室注射后發(fā)現(xiàn)A,B兩組大鼠體重增長明顯慢于正常組,并且A,B兩組間體重增長無明顯區(qū)別(P>0.05)。對于大鼠正常走動痛行為學(xué)評分,A組于第

15、10天側(cè)腦室注射Ad-NEP后,于第12天起疼痛行為評分下降趨勢明顯小于B組(P<0.05)。大鼠機(jī)械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學(xué)測定,我們發(fā)現(xiàn)從接種第12天起,也就是側(cè)腦室注射后第2天開始,不管是患側(cè)還是患肢對側(cè),A組大鼠的痛閾相對于B組大鼠均有了顯著提高(P<0.01)。這種顯著性差異患側(cè)一直持續(xù)到接種手術(shù)后第20天,患肢對側(cè)持續(xù)至第18天才消失。放射免疫分析法測定腦脊液標(biāo)本中b-EP濃度的結(jié)果顯示,在側(cè)腦室注射5×10

16、9PFU滴度的Ad-NEP后第4天起A組大鼠的腦脊液β-EP濃度大幅度提高。病毒注射組大鼠側(cè)腦室注射后第4天的大腦組織免疫熒光照片顯示,側(cè)腦室注射后,A組大鼠側(cè)腦室周邊致密分布著Ad-NEP的表達(dá)產(chǎn)物b-EP。
　　結(jié)論：
　　1.利用Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞可以成功構(gòu)建大鼠脛骨癌痛模型,并且易于復(fù)制。
　　2.容積30ml,滴度5×109、5×1010PFU的重組腺病毒Ad-NEP是比較適合大鼠側(cè)腦室注射的病