表達β-內啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)治療大鼠骨癌痛的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性疼痛是目前最常見也是最缺乏有效治療手段的疾病。對于那些晚期癌痛患者,疼痛往往成為他們生命最后階段最為痛苦的經歷。有研究顯示約有三分之二的晚期癌痛患者會發(fā)生骨轉移,骨轉移也被認為是癌癥引起疼痛最為常見的原因,腫瘤細胞的不斷浸潤,正常的骨質結構遭到破壞,其結果是受侵犯骨在輕度受力的情況下即會出現劇烈的疼痛反應,這是影響晚期腫瘤患者生存質量的主要原因之一。有效的止痛治療已成為目前亟待解決的問題。靜脈或口服阿片類

2、藥物是緩解疼痛的有效方法,但又帶來諸多副作用,如過度鎮(zhèn)靜、呼吸抑制、便秘以及成癮等。病人自控鎮(zhèn)痛技術的出現,給癌痛患者帶來了福音,但同樣存在難以長期維持、增加感染機會、費用較高等問題。尋找更方便、有效、作用持久且經濟、安全的鎮(zhèn)痛方法,成為人們關注的熱點。近年來,用基因治療的方法來處理慢性疼痛,利用外源性載體介導內源性蛋白直接或間接作用于外周和中樞神經元,有著比化學藥物或蛋白制劑純度高、副作用少、耐受發(fā)生率低,且可利用載體表達的特異性和長

3、期性等優(yōu)勢,解決了臨床上長期用藥帶來的問題。
　　目前,有研究表明使用表達β-內啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)對CCI大鼠模型的疼痛治療有著積極的意義。那么,如果使用Ad-NEP對骨癌痛大鼠進行疼痛治療,是否也有積極的效果呢?本實驗擬構建攜帶β-內啡肽的重組腺病毒,并通過側腦室注射接種,轉染宿主室管膜細胞,長期高效地表達β-內啡肽,升高腦脊液中β-內啡肽的含量,經由腦脊液循環(huán)直接作用于脊髓節(jié)段μ型阿片受體(MOR)。通過 G蛋白

4、介導的信號傳導通路抑制神經元從c-fos和 c-jun基因的表達,從而抑制傷害性信號的上傳,增強抑制性調制系統的功能,改變神經元的可塑性來提高痛閾。本研究試圖嘗試慢性癌痛病人的長期治療的新途徑,為進一步研究腺病毒在中樞神經系統內的轉染效率及其安全性提供實驗依據。
　　方法：
　　1.大鼠脛骨癌痛模型的建立和可行性評估
　　將實驗大鼠分為腫瘤組,假手術組,和正常組三組。預先將Walker256大鼠乳腺癌細胞接種于剛斷奶的

5、幼鼠腹腔中,于種植的第7天抽取幼鼠含有腫瘤細胞的腹水,分離提取,而后將此腹水混合液注入腫瘤組實驗大鼠右側脛骨。假手術組注入滅活的腹水混合液,正常組大鼠不做處理。接種術后當天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天,每天同樣的時間點,將三組實驗大鼠進行大鼠正常走動痛行為學評分(The score of ambulatory pain),輻射熱刺激測痛以及機械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學測定。各組大鼠于接種后

6、第22天,于麻醉后,對其雙下肢進行CT掃描。CT掃描條件:80KV,50MA,矩陣512×512,層厚0.7mm。觀察右側脛骨骨質有無發(fā)生變化。以上實驗遵從隨機雙盲原則。
　　2.大鼠側腦室注射表達β-內啡肽的重組腺病毒(Ad-NEP)對腦脊液β-內啡肽濃度的影響。
　　我們使用病毒滴度為5×1011PFU的非增殖型第一代基因重組腺病毒 Ad-NEP,分別制備5×1010PFU、5×109PFU、5×108PFU、5×107

7、PFU四種不同滴度容積為30ml的待用病毒溶液。將實驗SD大鼠分為6組,其中A組,B組,C組,D組,E組分別對應5×107PFU,5×108PFU,5×109PFU,5×1010PFU,5×1011PFU五種不同滴度的Ad-NEP,F組為生理鹽水對照組。對應組別將五種不同滴度的Ad-NEP分別注入相應組別健康正常大鼠側腦室,在注射后第4天采集大鼠腦脊液并測定其中β-EP濃度。同時,F組于對應時間注射生理鹽水進行對照。統計分析各個不同濃度

8、組以及正常對照組的大鼠腦脊液β-EP濃度值,將病毒滴度對數值與腦脊液β-EP濃度值作相關性分析,推定適合大鼠側腦室注射的病毒滴度并討論表達物與所注射病毒滴度的相關性。
　　3.腺病毒Ad-NEP側腦室注射后對于骨癌痛大鼠疼痛的影響。
　　根據第二部分實驗結果制備滴度為5×109 PFU的Ad-NEP。根據第一部分實驗結果使用 walker256大鼠乳腺癌細胞建立大鼠脛骨癌痛模型。實驗大鼠隨機分為Ad-NEP組(A組),對照組

9、(B組)和正常組(C組)。前兩組實驗動物均按照第一部分實驗方法復制大鼠脛骨癌痛模型。而后在接種第10天Ad-NEP組大鼠側腦室注射5×109 PFU的Ad-NEP,對照組注射等容量的生理鹽水。正常組大鼠不做任何處理。同時在接種含有腫瘤細胞的腹水手術后的當天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天,每天同樣的時間點,將三組實驗大鼠進行測量體重,正常走動痛行為學評分(The score of ambulatory pai

10、n),輻射熱刺激測痛以及機械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學測定。此外,以側腦室注射日為0天,在側腦室注射Ad-NEP后的第2,4,8,12天,分別在當日行為學評估之后進行三組實驗大鼠腦脊液的抽取,并使用放射免疫分析法(Radial Immunoassay,RIA)測定腦脊液標本中b-EP濃度。Ad-NEP組實驗大鼠于接種后22天也就是側腦室注射后第12天,在進行行為學測定以及腦脊液抽取后進行腦組織的取材。取材之后標本進行切片,

11、并熒光染色。以上實驗遵從隨機雙盲原則。
　　結果：
　　1.腫瘤組有兩只大鼠在術后第7天出現不可預見的死亡。假手術組自術后第二天其飲水進食均正常,無出現死亡。在手術第1周,腫瘤組的體重和其他兩組無明顯區(qū)別,第2周開始腫瘤組體重增長慢于其他兩組,到第3周差距更加明顯。術后第6天始,腫瘤組15只大鼠中2只評分為3分。術后第18天,腫瘤組所有大鼠正常走動痛行為學評分均為1分。假手術組和正常組大鼠術后第2天開始觀察,步態(tài)正常,評分均

12、為4分。對于大鼠輻射熱刺激測痛的行為學評估,通過測試,我們發(fā)現各組熱痛覺過敏潛伏期差異均無統計學意義。對于大鼠機械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學測定,測試發(fā)現腫瘤組在行走痛行為學評分較高的早期,接種側后肢和對側后肢相比無統計學改變,但當出現患側后足明顯不負重時,此時會出現2-3天的機械痛超敏期。同一只大鼠在接種后的早期,測得一穩(wěn)定的和基礎值相近的痛閾值。當出現痛敏時,同樣條件測到的痛閾值和前者有明顯統計學差異(P<0.01)。

13、除此以外,機械性誘發(fā)痛覺超敏時期患側和對側的痛閾值也有明顯的統計學差異(P<0.05)。大鼠影像學結果,接種手術后第22天,腫瘤組有兩只大鼠CT掃面見腫瘤并未侵蝕右側脛骨,后行解剖發(fā)現腫瘤侵蝕右側脛骨外組織直至皮下。其余腫瘤組大鼠CT掃面均可見右側脛骨上段干骺端骨皮質變薄,蟲蝕狀改變,透光性增加。假手術組及正常組均未發(fā)現有腫瘤侵蝕。
　　2. E組實驗大鼠在側腦室注射后陸續(xù)全部死亡。其余4個實驗組無實驗大鼠死亡,并且這4個實驗組組

14、間數據均有顯著統計學差異(P﹤0.01)。其中A、B組與正常對照組(F組)數據無顯著統計學差異(P>0.05);C、D組與正常對照組(F組)相比均有顯著差異(P﹤0.01)。
　　3.各組大鼠接種手術一周內的體重無明顯區(qū)別,但從第二周開始A組B組體重增長慢于C組,到第三周,其差距更加明顯,側腦室注射后發(fā)現A,B兩組大鼠體重增長明顯慢于正常組,并且A,B兩組間體重增長無明顯區(qū)別(P>0.05)。對于大鼠正常走動痛行為學評分,A組于第

15、10天側腦室注射Ad-NEP后,于第12天起疼痛行為評分下降趨勢明顯小于B組(P<0.05)。大鼠機械撤爪閾值(von Frey閾值)的行為學測定,我們發(fā)現從接種第12天起,也就是側腦室注射后第2天開始,不管是患側還是患肢對側,A組大鼠的痛閾相對于B組大鼠均有了顯著提高(P<0.01)。這種顯著性差異患側一直持續(xù)到接種手術后第20天,患肢對側持續(xù)至第18天才消失。放射免疫分析法測定腦脊液標本中b-EP濃度的結果顯示,在側腦室注射5×10

16、9PFU滴度的Ad-NEP后第4天起A組大鼠的腦脊液β-EP濃度大幅度提高。病毒注射組大鼠側腦室注射后第4天的大腦組織免疫熒光照片顯示,側腦室注射后,A組大鼠側腦室周邊致密分布著Ad-NEP的表達產物b-EP。
　　結論：
　　1.利用Walker256大鼠乳腺癌細胞可以成功構建大鼠脛骨癌痛模型,并且易于復制。
　　2.容積30ml,滴度5×109、5×1010PFU的重組腺病毒Ad-NEP是比較適合大鼠側腦室注射的病