重組雙自殺基因腺病毒Ad-Cp-CDglyTK靶向治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鼻咽癌是華南地區(qū)常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤，放療是目前首選的治療方法，近年單純放療5年生存率一直徘徊在50-60﹪之間，早期效果較好，中晚期效果明顯降低，第二次放療僅25﹪患者有效，5年生存率下降為12～23﹪，且放射損害性大，第三次放療則基本無(wú)效，因此許多腫瘤學(xué)家致力于尋找有效的化療方案，但研究結(jié)果并不一致，腫瘤局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因，因此探尋更有效的治療方法仍是目前鼻咽癌研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。 腫瘤基因治療成為近

2、20年來(lái)的熱點(diǎn)，許多基因治療方案也從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。自殺基因療法是其中研究比較多的一種腫瘤基因療法，其原理是將一些病毒或細(xì)菌基因組中的前藥轉(zhuǎn)換酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，這種基因可以編碼特殊的酶，將原先無(wú)毒性的前藥在腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，由于腫瘤自殺基因治療療效確切，一些研究已進(jìn)入臨床Ⅱ/Ⅲ期階段。 Epstein-Barr病毒(EBV)和NPC有著密切的關(guān)系，在EBV誘導(dǎo)NPC細(xì)胞所表達(dá)的特異性

3、抗原中，核抗原1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)是唯一在潛伏感染和裂解性感染時(shí)都表達(dá)的核蛋白，其生理作用是維持潛伏感染時(shí)EBV拷貝數(shù)的穩(wěn)定，并有利于EBV在宿主細(xì)胞中的免疫逃逸。Cp是負(fù)責(zé)EBNA1基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)啟動(dòng)子，其DNA序列存在多個(gè)EBNA1基因表達(dá)的調(diào)控位點(diǎn)，因此我們?cè)诒狙芯恐胁捎肅p的-248bp至+76bp序列作為自殺基因的特異性啟動(dòng)子，構(gòu)建CD-TK雙自殺基因靶向腺病毒載體Ad

4、-Cp-CDglyTK，探討Cp啟動(dòng)子能否特異性調(diào)控自殺基因在轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)，從而達(dá)到靶向性治療鼻咽癌的目的。 第1章重組腺病毒質(zhì)粒pDC316-Cp-CDglyTK構(gòu)建高保真PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增tk基因，回收PCR產(chǎn)物并用HindⅢ+SalⅠ進(jìn)行酶切，再回收產(chǎn)物，同時(shí)采用HindⅢ+SalⅠ酶切穿梭質(zhì)粒pDC3 16，回收線性化載體片段，T<,4>DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連

5、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5 α，挑取克隆，抽提質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pDC316-TK，再用EcoRI+HindⅢ酶切所構(gòu)建質(zhì)粒，回收線性化質(zhì)粒片段。同時(shí)高保真PCR擴(kuò)增cd基因，回收并用HindⅢ+EcoRⅠ酶切，回收片段，與pDC316-TK酶切線性化片段經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、篩選等方法得到重組質(zhì)粒pDC316-CDglyTK，XbaⅠ+EcoRⅠ酶切質(zhì)粒，回收線性化片段以備用。另外，高保真PCR擴(kuò)增Cp啟動(dòng)子，XbaⅠ+Ec

6、oRⅠ酶切PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物，與pDC316-CDglyTK酶切片段經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、篩選等方法到重組質(zhì)粒pDC316-Cp-CDglyTK。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR電泳、酶切電泳法及DNA測(cè)序法等證明tk、cd、cp基因序列插入方向正確。 第2章重組腺病毒AdCp-CDglyTK包裝純化當(dāng)HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至80～90﹪融合時(shí)，取骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1、E3Cre和質(zhì)粒pDC316-CP-CDglyTK，用Lip

7、ofectamine2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，2h后換成含5﹪的培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14天至出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，收集病變細(xì)胞，37℃、-70℃反復(fù)凍融3次，取1/3病毒上清液再感染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，3天后收集細(xì)胞，PBS重懸，反復(fù)凍融3次，最后CsC1梯度離心純化，-80℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增后的病毒滴度采用快速腺病毒滴度TCID50檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，病毒滴度為5.6×10<'9>TCID50/ml。 第3章逆轉(zhuǎn)

8、錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)CDglyTK基因體外表達(dá)CNE1、NP69細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別加入病毒載體(MOI為100∶1)，感染2h，吸去上清，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，兩組細(xì)胞各取總RNA1μg于20μl逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，各組取cDNA模板2μl在25μl體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。上游引物序列為5’-tgacttactggcaggtgctg-3’，下游引物：5’-atgetgcccataag

9、gtatcg-3’，預(yù)期擴(kuò)增針對(duì)tk基因的約300bp片段。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2﹪瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR結(jié)果示鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染電泳圖中300bp處為預(yù)期條帶，證明CNE1細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)入融合基因，而NP69細(xì)胞株未表達(dá)Cp-CD-TK基因。 第4章 MTT法觀察Ad-Cp-CDglyTK/5-FC+GCV體外抑制CNE細(xì)胞作用CNE1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)共分GCV、5-FC、GCV+5-FC三組，GCV的終濃度分別為2、10、25、50、7

10、5、100、200μg/ml，5-FC的終濃度分為20、50、100、200、400、800、1600μg/ml， NP69細(xì)胞株作為對(duì)照組，只采用GCV+5-FC聯(lián)合用藥方式，GCV、5-FC終濃度同上。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE1細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，按3000個(gè)細(xì)胞/孔接種于含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔培養(yǎng)板中，NP69細(xì)胞則采用Keratinocyte-SFM無(wú)血清培養(yǎng)液，于37℃、含5﹪CO<,2>的條件下

11、培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)到80﹪的融合度時(shí)，病毒原液用相應(yīng)的培養(yǎng)液稀釋后(MOI為100)感染細(xì)胞，24小時(shí)后按上述設(shè)計(jì)方案分別給予GCV、5-FC前體藥進(jìn)行處理，每孔總量為200μl，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，提前4 h每孔加入10μl 10mg/ml MTT溶液，吸去上清，每孔加入150μlDMSO液，震蕩5min，待藍(lán)色溶解后，測(cè)定各孔0.D<,570>值，計(jì)算相對(duì)抑制率后繪制劑量-效應(yīng)曲線，數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組問(wèn)數(shù)

12、據(jù)比較采用x<'2>檢驗(yàn)。 結(jié)果：重組腺病毒感染CNE1與NP69細(xì)胞株后，單獨(dú)GCV、5-FC給藥組對(duì)CNE1都具有較高的抑制作用，但兩者之間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.1)，聯(lián)合用藥組對(duì)CNE1的抑制作用最強(qiáng)，與單獨(dú)用藥有明顯統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05)，NP69細(xì)胞株對(duì)GCV+5-FC聯(lián)合用藥未表現(xiàn)出明顯的敏感性，與其他三組也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論：Cp啟動(dòng)子可以特異性調(diào)控CDglyTK融合自殺基因