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文檔簡介
1、鼻咽癌是華南地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤,放療是目前首選的治療方法,近年單純放療5年生存率一直徘徊在50-60﹪之間,早期效果較好,中晚期效果明顯降低,第二次放療僅25﹪患者有效,5年生存率下降為12~23﹪,且放射損害性大,第三次放療則基本無效,因此許多腫瘤學(xué)家致力于尋找有效的化療方案,但研究結(jié)果并不一致,腫瘤局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因,因此探尋更有效的治療方法仍是目前鼻咽癌研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。 腫瘤基因治療成為近
2、20年來的熱點(diǎn),許多基因治療方案也從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。自殺基因療法是其中研究比較多的一種腫瘤基因療法,其原理是將一些病毒或細(xì)菌基因組中的前藥轉(zhuǎn)換酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,這種基因可以編碼特殊的酶,將原先無毒性的前藥在腫瘤細(xì)胞中代謝為毒性產(chǎn)物,從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的,由于腫瘤自殺基因治療療效確切,一些研究已進(jìn)入臨床Ⅱ/Ⅲ期階段。 Epstein-Barr病毒(EBV)和NPC有著密切的關(guān)系,在EBV誘導(dǎo)NPC細(xì)胞所表達(dá)的特異性
3、抗原中,核抗原1(Epstein-Barr nuclear antigen 1,EBNA1)是唯一在潛伏感染和裂解性感染時都表達(dá)的核蛋白,其生理作用是維持潛伏感染時EBV拷貝數(shù)的穩(wěn)定,并有利于EBV在宿主細(xì)胞中的免疫逃逸。Cp是負(fù)責(zé)EBNA1基因轉(zhuǎn)錄的一個啟動子,其DNA序列存在多個EBNA1基因表達(dá)的調(diào)控位點(diǎn),因此我們在本研究中采用Cp的-248bp至+76bp序列作為自殺基因的特異性啟動子,構(gòu)建CD-TK雙自殺基因靶向腺病毒載體Ad
4、-Cp-CDglyTK,探討Cp啟動子能否特異性調(diào)控自殺基因在轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá),從而達(dá)到靶向性治療鼻咽癌的目的。 第1章重組腺病毒質(zhì)粒pDC316-Cp-CDglyTK構(gòu)建高保真PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增tk基因,回收PCR產(chǎn)物并用HindⅢ+SalⅠ進(jìn)行酶切,再回收產(chǎn)物,同時采用HindⅢ+SalⅠ酶切穿梭質(zhì)粒pDC3 16,回收線性化載體片段,T<,4>DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),連
5、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5 α,挑取克隆,抽提質(zhì)粒DNA,得到重組質(zhì)粒pDC316-TK,再用EcoRI+HindⅢ酶切所構(gòu)建質(zhì)粒,回收線性化質(zhì)粒片段。同時高保真PCR擴(kuò)增cd基因,回收并用HindⅢ+EcoRⅠ酶切,回收片段,與pDC316-TK酶切線性化片段經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、篩選等方法得到重組質(zhì)粒pDC316-CDglyTK,XbaⅠ+EcoRⅠ酶切質(zhì)粒,回收線性化片段以備用。另外,高保真PCR擴(kuò)增Cp啟動子,XbaⅠ+Ec
6、oRⅠ酶切PCR產(chǎn)物,回收產(chǎn)物,與pDC316-CDglyTK酶切片段經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、篩選等方法到重組質(zhì)粒pDC316-Cp-CDglyTK。重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR電泳、酶切電泳法及DNA測序法等證明tk、cd、cp基因序列插入方向正確。 第2章重組腺病毒AdCp-CDglyTK包裝純化當(dāng)HEK293細(xì)胞長至80~90﹪融合時,取骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1、E3Cre和質(zhì)粒pDC316-CP-CDglyTK,用Lip
7、ofectamine2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,2h后換成含5﹪的培養(yǎng)液,培養(yǎng)10~14天至出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),收集病變細(xì)胞,37℃、-70℃反復(fù)凍融3次,取1/3病毒上清液再感染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增,3天后收集細(xì)胞,PBS重懸,反復(fù)凍融3次,最后CsC1梯度離心純化,-80℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增后的病毒滴度采用快速腺病毒滴度TCID50檢測試劑盒進(jìn)行測定,病毒滴度為5.6×10<'9>TCID50/ml。 第3章逆轉(zhuǎn)
8、錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測CDglyTK基因體外表達(dá)CNE1、NP69細(xì)胞于對數(shù)生長期分別加入病毒載體(MOI為100∶1),感染2h,吸去上清,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA,兩組細(xì)胞各取總RNA1μg于20μl逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA,各組取cDNA模板2μl在25μl體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。上游引物序列為5’-tgacttactggcaggtgctg-3’,下游引物:5’-atgetgcccataag
9、gtatcg-3’,預(yù)期擴(kuò)增針對tk基因的約300bp片段。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2﹪瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR結(jié)果示鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染電泳圖中300bp處為預(yù)期條帶,證明CNE1細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)入融合基因,而NP69細(xì)胞株未表達(dá)Cp-CD-TK基因。 第4章 MTT法觀察Ad-Cp-CDglyTK/5-FC+GCV體外抑制CNE細(xì)胞作用CNE1細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)共分GCV、5-FC、GCV+5-FC三組,GCV的終濃度分別為2、10、25、50、7
10、5、100、200μg/ml,5-FC的終濃度分為20、50、100、200、400、800、1600μg/ml, NP69細(xì)胞株作為對照組,只采用GCV+5-FC聯(lián)合用藥方式,GCV、5-FC終濃度同上。 取對數(shù)生長期CNE1細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù),按3000個細(xì)胞/孔接種于含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔培養(yǎng)板中,NP69細(xì)胞則采用Keratinocyte-SFM無血清培養(yǎng)液,于37℃、含5﹪CO<,2>的條件下
11、培養(yǎng),鏡下觀察細(xì)胞生長到80﹪的融合度時,病毒原液用相應(yīng)的培養(yǎng)液稀釋后(MOI為100)感染細(xì)胞,24小時后按上述設(shè)計(jì)方案分別給予GCV、5-FC前體藥進(jìn)行處理,每孔總量為200μl,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,提前4 h每孔加入10μl 10mg/ml MTT溶液,吸去上清,每孔加入150μlDMSO液,震蕩5min,待藍(lán)色溶解后,測定各孔0.D<,570>值,計(jì)算相對抑制率后繪制劑量-效應(yīng)曲線,數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組問數(shù)
12、據(jù)比較采用x<'2>檢驗(yàn)。 結(jié)果:重組腺病毒感染CNE1與NP69細(xì)胞株后,單獨(dú)GCV、5-FC給藥組對CNE1都具有較高的抑制作用,但兩者之間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.1),聯(lián)合用藥組對CNE1的抑制作用最強(qiáng),與單獨(dú)用藥有明顯統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05),NP69細(xì)胞株對GCV+5-FC聯(lián)合用藥未表現(xiàn)出明顯的敏感性,與其他三組也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論:Cp啟動子可以特異性調(diào)控CDglyTK融合自殺基因
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