重組腺病毒Ad-MMP-1體外感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究.pdf

1、肝纖維化,是肝臟在各種致病因子(病毒、酒精、免疫損傷等)持續(xù)刺激下,導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc,ECM)異常過度沉積所致,是慢性肝病的病理基礎(chǔ)和發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路,目前對(duì)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)仍無特效藥物。近年來大量研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有在體內(nèi)外向肝細(xì)胞分化的潛能,有望修復(fù)或者逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。而基因修飾的干細(xì)胞既保持了

2、定向分化的特性,同時(shí)可產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子,提高療效從而彌補(bǔ)單純MSCs移植治療的不足。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs),在肝內(nèi)主要由肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)和Kupffer細(xì)胞表達(dá)分泌,參與ECM降解的一類鋅-鈣離子依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能分解纖維類膠原的酶,幾乎能降解除多糖以外的所有ECM成分,在生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用。M

3、MP-1又稱成纖維細(xì)胞型,是人類主要的間質(zhì)膠原酶,降解以I型膠原為主的ECM,從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程。
　　目的:
　　本研究擬通過體外分離和原代培養(yǎng)大鼠BMSCs,流式法鑒定其免疫表型;以攜帶GFP標(biāo)記的重組腺病毒載體將hMMP1基因?qū)氪笫驜MSCs,并以BMSCs為空白對(duì)照,以轉(zhuǎn)染Ad-GFP的BMSCs為陰性對(duì)照;通過熒光顯微鏡觀察和流式法確定最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI);MT

4、T法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖狀況;ELIS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP1蛋白的表達(dá);RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs中hMMP1基因和蛋白的表達(dá);為下一步hMMP-1基因修飾的MSCs治療肝纖維化奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs;采用流式法鑒定干細(xì)胞免疫表型,包括:CD45、CD90、CD105、CD14、CD34和CD79a。
　　2.重組腺病

5、毒載體Ad-hMMP1-eGFP的構(gòu)建、鑒定與包裝,重疊PCR反應(yīng)擴(kuò)增hMMP-1基因,Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)克隆pAd-hMMP-1-eGFP。經(jīng)PacⅠ酶切線性化轉(zhuǎn)入HEK293A細(xì)胞包裝獲得重組腺病毒Ad-hMMP-1-eGFP,熒光顯微鏡下觀察重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,測(cè)定病毒滴度,Western-Blot法檢測(cè)hMMP-1蛋白表達(dá)。
　　3.重組腺病毒Ad-hMMP-1-eGFP體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSC,熒光顯微

6、鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并確定MOI,MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況,RT-PCR及Westeronblot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)hMMP-1基因和蛋白表達(dá)情況,ELISA法檢測(cè)上清中hMMP-1蛋白表達(dá)情況,hMMP-1酶活性熒光定量試劑盒測(cè)定其活性。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果表明第3代BMSCs高表達(dá)特異性標(biāo)記CD90(99.6％)、CD105(9

7、9.8%),不表達(dá)造血系干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45(0.1%)、CD14(0.1%)、CD34(0.3%)、CD79a(0.1%)。
　　2.經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)入門載體和目的載體中均含有hMMP-1目的基因。重組腺病毒Ad-hMMP-1-eGFP感染293A細(xì)胞后4天觀察到綠色熒光表達(dá),10天-12天熒光強(qiáng)度達(dá)最高,收集病毒液;測(cè)定病毒滴度為4.84×1010PFU/ml,Western-Blot法檢測(cè)重組腺病毒中目的蛋白高效表達(dá)。

8、
　　3.重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后24h可見綠色熒光表達(dá),72h熒光強(qiáng)度最高,最佳MOI值為200。MTT檢測(cè)示3組細(xì)胞均于第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,6d后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期;3組間細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RT-PCR、Westeronblot及ELISA檢測(cè)示,對(duì)照組(A、B組)均無hMMP-1基因和蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)組(C組)hMMP-1基因和蛋白均高效表達(dá),顯著高于對(duì)照組水平(P<0.01)。熒光定量試劑盒

9、測(cè)定A、B組均未檢測(cè)到MMP-1活性,C組MMP-1活性為1.24nmol/(mg·min)。
　　結(jié)論:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　2.利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建含人基質(zhì)金屬蛋白酶-1(hMMP-1)基因的重組腺病毒載體,與傳統(tǒng)構(gòu)建方法相比具有高效性和特異性;
　　3.將重組腺病毒Ad-hMMP-1成功導(dǎo)入大鼠BMSCs,hMMP-1基因和蛋白在BMSCs中呈高效表達(dá)