BrdU標(biāo)記的HCMV感染HEL細(xì)胞、大鼠腦組織和U-,251-細(xì)胞的研究.pdf

1、目的(1)以標(biāo)記在人巨細(xì)胞病毒(HCMV)DNA 上的BrdU為示蹤劑，研究HCMV在HEL細(xì)胞中的移動(dòng)規(guī)律；同時(shí)結(jié)合HCMV蛋白IEl及pp65的分布及表達(dá)特點(diǎn)探討病毒復(fù)制增殖的過(guò)程。(2)建立BrdU標(biāo)記HCMV感染SD大鼠腦組織的模型；探討大鼠CNS神經(jīng)元對(duì)HCMV的容許性，受染細(xì)胞數(shù)與病毒感染量和感染時(shí)間的相關(guān)性。(3)研究U<,251>細(xì)胞對(duì)HCMV的容許性，并探討病毒蛋白IEl及pp65的分布及表達(dá)特點(diǎn)。 方法(1)

2、以BrdU標(biāo)記HCMV DNA，測(cè)定其PFU值；以MOI=4的病毒量感染HEL細(xì)胞，分別在2h p.i.、4h p.i.、6h p.i.、8h P.i.、12h p.i.、24h p.i.及48h p.i.時(shí)用抗BrdU單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色；分別用抗HCMV蛋白IEl及pp65單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行灰度值測(cè)定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析探討此兩種蛋白的分布及表達(dá)特點(diǎn)。(2)將15只SD大鼠隨

3、機(jī)分為病毒感染組(12只)及對(duì)照組(3只)，病毒感染組根據(jù)感染時(shí)間分為三組：24h p.i.、48h p.i.及96h p.i.，每個(gè)感染時(shí)間組再分為2μl及4μl兩個(gè)劑量組，均以腦內(nèi)注射途徑將BrdU標(biāo)記的HCMV(MOI=4)直接注入大腦海馬部位；每個(gè)感染時(shí)間組設(shè)立一只陰性對(duì)照，于同一部位注入不含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(4μl)；術(shù)后分籠飼養(yǎng)，于各感染時(shí)間點(diǎn)處理鼠取腦，經(jīng)固定、浸糖處理后冰凍切片，應(yīng)用抗BrdU單克隆抗體及抗MAP<,

4、2>單克隆抗體的混合抗體對(duì)海馬周圍部位腦片進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，應(yīng)用抗病毒蛋白pp65單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色及Nissil復(fù)染。(3)HCMV感染U<,251>細(xì)胞，于15min p.i.、30min p.i.、1h p.i.、2h p.i.、4h p.i.、6h p.i.、8h p.i.、10h p.i.、12h p.i.、14h p.i.、24h p.i.、48h p.i.、72h p.i.、96h p.i.及120h p.i.

5、時(shí)分別用抗蛋白IEl及pp65單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行灰度值測(cè)定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析探討此兩種蛋白的分布及表達(dá)特點(diǎn)。 結(jié)果(1)免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果提示病毒DNA依次位于胞質(zhì)(2hp.i)、胞核(4h p.i.～24h p.i.)及同時(shí)位于胞核和胞質(zhì)(48h p.i.)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：蛋白IEl僅在核內(nèi)表達(dá)，表達(dá)量在4h p.i.達(dá)高峰后明顯降低，至8h p.i.時(shí)不能檢測(cè)到

6、；蛋白pp65分布規(guī)律為胞核分布(4h p.i.～12h p.i.)、胞核與胞漿同時(shí)分布(24h p.i.)及巨細(xì)胞和融合細(xì)胞內(nèi)分布(48h p.i.)，表達(dá)量于2h p.i.～6h p.i.間呈上升趨勢(shì)，8h p.i.～24h p.i.穩(wěn)定表達(dá)，48h p.i.表達(dá)降低。(2)24h p.i.，病毒感染組腦片中未檢測(cè)到標(biāo)記病毒及蛋白pp65；48h p.i.及96h p.i.，在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中檢測(cè)到了標(biāo)記病毒DNA的陽(yáng)性熒光及蛋

7、白pp65的陽(yáng)性著色，并發(fā)現(xiàn)受染細(xì)胞數(shù)與感染劑量呈正相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)與感染時(shí)間的相關(guān)性。(3)4h p.i.～120h p.i.均能檢測(cè)到蛋白IE1表達(dá)于U<,251>細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)量在14h p.i.前呈上升趨勢(shì)、之后表現(xiàn)為下降趨勢(shì)：蛋白pp65在1h p.i.～96hp.i.分布于核內(nèi)，120h p.i.時(shí)分布于融合細(xì)胞內(nèi)，蛋白pp65首先于1h p.i.時(shí)被檢測(cè)到，至96h p.i.均呈持續(xù)低水平表達(dá)，于120h p.i.出現(xiàn)一表達(dá)高

8、峰。 結(jié)論(1)運(yùn)用示蹤劑BrdU成功地探討了HCMV在HEL細(xì)胞中的移動(dòng)及復(fù)制增殖過(guò)程，此標(biāo)記技術(shù)為更深入研究HCMV奠定了基礎(chǔ)。(2)成功建立了以BrdU標(biāo)記HCMV感染SD大鼠腦組織的模型：證明了大鼠CNS神經(jīng)元對(duì)HCMV的容許性：由受染細(xì)胞量與感染劑量呈正相關(guān)，而與感染時(shí)間無(wú)關(guān)，推測(cè)HCMV在SD大鼠CNS中呈潛伏感染狀態(tài)。(3)U<,251>細(xì)胞是HCMV的容許細(xì)胞；HCMV在U<,251>細(xì)胞內(nèi)呈低水平復(fù)制狀態(tài)；蛋白I