腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體DNA突變及Idebenone對U251和C6細(xì)胞活性抑制的研究.pdf

1、目的:線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)單元，而且還參與多種細(xì)胞活動，包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞復(fù)制、細(xì)胞凋亡等。線粒體含有自己的DNA系統(tǒng)，可以進行獨立于核DNA之外的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄參與電子轉(zhuǎn)遞過程的23種酶。和正常細(xì)胞不同的是，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生了很多改變，其中包括線粒體DNA突變，電子傳遞鏈的中斷，線粒體膜電位的變化以及以線粒體為中心的細(xì)胞凋亡過程的抑制等。同時，腫瘤細(xì)胞采用有氧糖酵解過程作為能量供應(yīng)主要來源也是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞

2、的主要差別之一，并且有氧糖酵解過程中產(chǎn)生的能量隨著腫瘤級別的增加而增加。為了探討膠質(zhì)瘤治療的新途經(jīng)，探索可以活化正常細(xì)胞線粒體功能、增加氧化磷酸的藥物對腫瘤細(xì)胞的作用，我們進行了本次研究。 方法: 1．提取U251細(xì)胞中的線粒體DNA，設(shè)計ATP6ase和ND6基因相應(yīng)的引物，對ATP6ase及ND6基因進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序。將測序結(jié)果和人類正常線粒體基因相比對，找出差別。 2．使用U251、C6兩

3、種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。觀察終濃度為20、30、40μ M的Idebenone對其生長曲線的影響。通過檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明和JC-1的熒光強度，觀察不同濃度的Idebenone對線粒體膜電位的影響；通過檢測DCFH-DA熒光強度，觀察Idebenone對細(xì)胞內(nèi)ROS生成和通過免疫組化方法檢測Idebenone對PRDX3表達(dá)的影響；通過檢測細(xì)胞和線粒體提取液中螢火蟲熒光素酶強度，觀察Idebenone對兩者內(nèi)ATP的影響。 結(jié)果:

4、1．Blast比對顯示U251 ATP6ase基因較正?；蛳啾却嬖贏8660G改變，ND6較正常沒有明顯變化。 2．我們發(fā)現(xiàn)Idebenone可以抑制兩種腫瘤細(xì)胞的生長，且這種抑制作用隨著藥物濃度的增加而明顯。Idebenone可以降低線粒體膜電位，但是這種作用有一定的時間期限。Idebenone增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，且ROS的濃度隨著Ideenone的濃度增加而增加；Idebenone可以降低細(xì)胞內(nèi)PRDX3的表達(dá)。Ide

5、benone可以減少細(xì)胞內(nèi)ATP濃度，同時這種作用隨著藥物濃度增加而增加；但是對兩種細(xì)胞氧化磷酸化途經(jīng)的ATP生成沒有明顯影響。 結(jié)論: 1．L3251細(xì)胞中ATP6ase基因存在點突變，且突變位點具有罕見多態(tài)性，提示A8860G可能與膠質(zhì)瘤有關(guān)；同時分析顯示出現(xiàn)氨基酸缺失，提示ATP6ase功能可能出現(xiàn)障礙，影響經(jīng)線粒體途經(jīng)的ATP合成。 2．Idebenone在安全濃度范圍內(nèi)可以通過線粒體途經(jīng)抑制腫瘤細(xì)胞的生