釀酒酵母Pdr5p對(duì)麥角甾醇代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、真菌耐藥性已成為真菌感染治療上一個(gè)日益嚴(yán)峻的問題，由于麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜上獨(dú)特的脂類成分(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中不含麥角甾醇而只含膽固醇)，因此一直被作為設(shè)計(jì)抗真菌藥物的最佳靶標(biāo)之一。
　　 真菌細(xì)胞中的脂類(包括麥角甾醇)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的途徑有兩種：小泡轉(zhuǎn)運(yùn)和非小泡轉(zhuǎn)運(yùn)。非小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控機(jī)制一直沒有清楚闡述，近期的研究發(fā)現(xiàn)：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)，除了具有結(jié)合和外

2、排底物分子(包括藥物分子)的泵功能外，還與細(xì)胞中脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝有著密切關(guān)系。本論文利用模式真菌細(xì)胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，初步研究了其中重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pdr5p對(duì)酵母細(xì)胞膜中麥角甾醇水平調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　 首先，論文通過同源雙交換的方法分別構(gòu)建pdr5、pdr10，yor1敲除菌株。耐藥性實(shí)驗(yàn)表明敲除PDR5會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)氟康唑的抗性下降，但是對(duì)多烯藥物兩性霉素B的抗性上升。由于兩性霉

3、素B與酵母細(xì)胞膜上的麥角甾醇結(jié)合形成孔道，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外流導(dǎo)致死亡，本論文通過高效液相色譜方法分析了pdr5敲除菌株中細(xì)胞膜上的麥角甾醇含量，發(fā)現(xiàn)較野生菌株下降約30％，但pdr10，yor1單敲菌株的細(xì)胞膜麥角甾醇含量均未發(fā)生顯著改變。說明Pdr5p對(duì)麥角甾醇的影響不是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的共有特性。
　　 在此基礎(chǔ)上，論文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了敲除PDR5后對(duì)麥角甾醇合成、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑上的基因及其它一些相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水

4、平上表達(dá)量的影響。研究發(fā)現(xiàn)麥角甾醇合成基因ERG3的表達(dá)下調(diào)，參與麥角甾醇酯化的基因ARE2表達(dá)上調(diào)，將酯化麥角甾醇水解為游離麥角甾醇的基因YEH1和YEH2的表達(dá)量下調(diào)。說明pdr5敲除后影響了麥角甾醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇的累積導(dǎo)致ERG3表達(dá)下調(diào)，以減少麥角甾醇的合成產(chǎn)量；同時(shí)還導(dǎo)致ARE2表達(dá)上調(diào)和YEH1、YEH2表達(dá)下調(diào)，用以將無法轉(zhuǎn)運(yùn)的麥角甾醇以酯化的形式存儲(chǔ)。
　　 OSH蛋白家族在脂類運(yùn)輸過程中