采用SELEX技術(shù)篩選玉米赤霉烯酮單克隆抗體DNA適配子的初步研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮( Zeara lnen o e, ZEN)是由鐮刀菌屬真菌在生長過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物, ZEN不僅可以直接污染多種谷物及飼料,還可以污染肉、蛋、奶等諸多動(dòng)物源性食品。ZEN具有類雌激素活性,可對(duì)人和動(dòng)物造成多種損害,包括生殖毒性、DNA損傷毒性、免疫抑制毒性等,嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康,因此準(zhǔn)確、及時(shí)監(jiān)測食品和飼料中的ZEN已是全世界關(guān)注的問題。SELEX技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Sys tematic Evo

2、 lutio n of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX),通過該技術(shù)可從體外人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出特定的核苷酸序列。由于寡核苷酸隨機(jī)區(qū)域的堿基隨機(jī)分布,可形成多種多樣的二級(jí)空間結(jié)構(gòu),只要庫容量足夠大可與任何靶分子結(jié)合,因此從隨機(jī)寡核苷酸庫中可以篩選出針對(duì)各類靶分子的適配子(ap tamer),即能與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的小分子DNA或RNA片段。適配子具有精確識(shí)別靶物質(zhì)

3、、制備周期短、易體外合成等優(yōu)點(diǎn),可以替代相應(yīng)的抗原或抗體。以玉米赤霉烯酮毒素的單克隆抗體為靶標(biāo),篩選具有抗原內(nèi)影像關(guān)系的DNA適配子替代毒素本身,在建立檢測方法時(shí)可不再使用毒素作為競爭抗原,從而研發(fā)出低毒、環(huán)保的檢測試劑盒,確保檢測毒素過程中對(duì)人類和環(huán)境的安全性。
　　本研究通過體外人工合成一個(gè)全長71個(gè)堿基、中間隨機(jī)序列為35nt的s sDNA文庫,采用SELEX技術(shù),以玉米赤霉烯酮單克隆抗體為靶分子,進(jìn)行15輪篩選,并利用生物

4、素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)測定每一輪富集文庫與ZEN單抗的親和力,將最后一輪富集文庫進(jìn)行克隆、測序,并運(yùn)用DNAMAN軟件分析適配子序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu),測定克隆子與玉米赤霉烯酮單克隆抗體的親和力,并進(jìn)一步采用所篩選適配子替代毒素建立相應(yīng)的檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過SELEX15輪的篩選,試驗(yàn)結(jié)果表明,每輪s sDNA富集文庫與玉米赤霉烯酮單克隆抗體的親和力呈上升趨勢,結(jié)合顯色后吸光度值從第1輪的0.125上升到第15輪的

5、0.666,提高了5.328倍。隨機(jī)挑選96個(gè)適配子進(jìn)行克隆和序列分析,然后對(duì)序列正確的適配子進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和親和性檢測。獲得63個(gè)適配子序列全長71b p,軟件分析預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu),說明莖環(huán)結(jié)構(gòu)是適配子與靶分子結(jié)合的基礎(chǔ)。其中46號(hào)克隆適配子親和力相對(duì)較高,以此適配子建立酶聯(lián)寡核苷酸試驗(yàn)(Enzyme-linked Oligonucleatide As s ay, ELO S A)檢測方法。方陣滴定確定的最佳條件為:Z

6、EN單抗最佳包被濃度為1μg/孔,適配子1:10稀釋后濃度為80n g/m l,辣根過氧化物酶標(biāo)的鏈霉親和素1:300稀釋后濃度為3μg/m l。用標(biāo)準(zhǔn)ZEN毒素溶液濃度分別為50.00、10.00、1.00、0.10、0.01、0.001、0.00 ng/m L作為競爭抗原,每個(gè)濃度做3個(gè)平行孔,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),獲得競爭抑制曲線穩(wěn)定。批內(nèi)差異7.6％,批間差異9.3%,差異率均小于10%,表明該方法有較好的可靠性,玉米赤霉烯酮單克隆