應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選胰腺癌細(xì)胞特異性適配子.pdf

1、目的：
　　 胰腺癌是一種難治性疾病，而且發(fā)病率有持續(xù)升高的趨勢。由于胰腺癌部位特殊，早期病例多無臨床癥狀，80％-90％的胰腺癌病人就診時已經(jīng)處于晚期，手術(shù)切除率只有15％，五年生存率1％-5％。然而早期胰腺痛的手術(shù)切除率為90％-100％，五年生存率可達(dá)70％-100％。因此，早期診斷和治療胰腺癌可以顯著提高病人生存率，明顯改善預(yù)后。近年來隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的逐漸深入，應(yīng)用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)成為了腫瘤研究的熱點(diǎn)，目前多集中

2、在胰腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物的分子生物學(xué)研究，若能通過分子生物學(xué)的方法尋找對胰腺癌既高度敏感又高度特異的腫瘤標(biāo)記物，將使胰腺癌的早期診斷和特異性的靶向治療成為可能。SELEX技術(shù)的出現(xiàn)則為腫瘤標(biāo)志物的尋找?guī)砹诵碌乃悸?。指?shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡稱SELEX（Systematic Evolution of Ligands by ponential Enrichment）技術(shù)，它是一種新的高通量生物文庫篩選技術(shù)，應(yīng)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文

3、庫（ssDNA文庫和RNA文庫），結(jié)合PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)級富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過反復(fù)的體外篩選、擴(kuò)增，最終獲得的寡核苷酸適體(aptamer)?；谛纬傻目臻g結(jié)構(gòu)與靶分子呈高特異性和高親和力的結(jié)合，又由于aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是近年來興起的復(fù)合靶SELEX技術(shù)，使得對未知靶分子進(jìn)行篩選成為可能，并且通過引入消減篩選

4、步驟，能夠獲得特異識別兩類復(fù)合靶分子上差異存在的aptamer，并能利用該配基反過來對靶分子進(jìn)行研究，這就為開發(fā)新型分子探針以及鑒定生物標(biāo)志物開辟了新的途徑。本研究主要圍繞消減SELEX展開，利用SELEX方法篩選出對胰腺癌細(xì)胞具有高度診斷特異性的寡核苷酸適配子，從而為胰腺癌的早期診斷和特異性的靶向治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　 實驗材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫及其相關(guān)引物。

5、　　 2、篩選的細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)試劑。
　　 3、PCR及電泳的相關(guān)試劑。
　　 4、細(xì)胞消減SELEX篩選的相關(guān)試劑。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡檢測的相關(guān)試劑。
　　 二、實驗方法
　　 1、確立消減篩選的兩種細(xì)胞株及建立隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫與相關(guān)引物的設(shè)計。
　　 2、運(yùn)用消減SELEX技術(shù)進(jìn)行數(shù)輪的篩選獲得富集文庫。
　　 3、確定特殊莖環(huán)引物PCR制備次級文

6、庫的最佳循環(huán)數(shù)及文庫模板量。
　　 4、采用特殊莖環(huán)引物PCR的方法對次級文庫進(jìn)行制備。
　　 5、采用流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡這兩種方法分別對文庫富集的情況進(jìn)行監(jiān)測。
　　 結(jié)果：
　　 在細(xì)胞消減SELEX過程中，我們從第四輪開始加入了消減細(xì)胞共進(jìn)行了七輪的篩選。同時我們采用特殊莖環(huán)引物PCR法對次級文庫進(jìn)行制備。在非對稱PCR的過程中我們發(fā)現(xiàn)36個循環(huán)數(shù)時目的條帶產(chǎn)量大且雜帶少，以此循環(huán)數(shù)作為最適循環(huán)

7、數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另外，文庫（模板）量適當(dāng)增加有助于增大目的條帶的產(chǎn)量且使非特異性的產(chǎn)物明顯減少。特殊莖環(huán)引物PCR的擴(kuò)增效率可指示富集情況，我們在對文庫富集情況進(jìn)行監(jiān)測時首先采用變性PAGE凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)隨著篩選輪次遞增，目的條帶出現(xiàn)遞減趨勢。同時采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定出現(xiàn)同樣結(jié)果，隨著篩選進(jìn)行熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，圖形右移越明顯。熒光顯微鏡觀察結(jié)果也一致。說明特異識別胰腺癌細(xì)胞BxPC-3的適配子正逐漸得到富集。
　　 結(jié)論：