應用SELEX技術篩選胰腺癌細胞特異性適配子.pdf

1、目的：
　　 胰腺癌是一種難治性疾病，而且發(fā)病率有持續(xù)升高的趨勢。由于胰腺癌部位特殊，早期病例多無臨床癥狀，80％-90％的胰腺癌病人就診時已經處于晚期，手術切除率只有15％，五年生存率1％-5％。然而早期胰腺痛的手術切除率為90％-100％，五年生存率可達70％-100％。因此，早期診斷和治療胰腺癌可以顯著提高病人生存率，明顯改善預后。近年來隨著基礎醫(yī)學研究的逐漸深入，應用細胞學和分子生物學技術成為了腫瘤研究的熱點，目前多集中

2、在胰腺癌相關的腫瘤標志物的分子生物學研究，若能通過分子生物學的方法尋找對胰腺癌既高度敏感又高度特異的腫瘤標記物，將使胰腺癌的早期診斷和特異性的靶向治療成為可能。SELEX技術的出現(xiàn)則為腫瘤標志物的尋找?guī)砹诵碌乃悸?。指?shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術，簡稱SELEX（Systematic Evolution of Ligands by ponential Enrichment）技術，它是一種新的高通量生物文庫篩選技術，應用大容量的隨機寡核苷酸文

3、庫（ssDNA文庫和RNA文庫），結合PCR體外擴增技術，以指數(shù)級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過反復的體外篩選、擴增，最終獲得的寡核苷酸適體(aptamer)?；谛纬傻目臻g結構與靶分子呈高特異性和高親和力的結合，又由于aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優(yōu)點，在基礎醫(yī)學、臨床診斷與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應用前景。尤其是近年來興起的復合靶SELEX技術，使得對未知靶分子進行篩選成為可能，并且通過引入消減篩選

4、步驟，能夠獲得特異識別兩類復合靶分子上差異存在的aptamer，并能利用該配基反過來對靶分子進行研究，這就為開發(fā)新型分子探針以及鑒定生物標志物開辟了新的途徑。本研究主要圍繞消減SELEX展開，利用SELEX方法篩選出對胰腺癌細胞具有高度診斷特異性的寡核苷酸適配子，從而為胰腺癌的早期診斷和特異性的靶向治療提供實驗基礎。
　　 實驗材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、隨機單鏈寡核苷酸文庫及其相關引物。

5、　　 2、篩選的細胞株及細胞培養(yǎng)的相關試劑。
　　 3、PCR及電泳的相關試劑。
　　 4、細胞消減SELEX篩選的相關試劑。
　　 5、流式細胞術與熒光顯微鏡檢測的相關試劑。
　　 二、實驗方法
　　 1、確立消減篩選的兩種細胞株及建立隨機單鏈寡核苷酸文庫與相關引物的設計。
　　 2、運用消減SELEX技術進行數(shù)輪的篩選獲得富集文庫。
　　 3、確定特殊莖環(huán)引物PCR制備次級文

6、庫的最佳循環(huán)數(shù)及文庫模板量。
　　 4、采用特殊莖環(huán)引物PCR的方法對次級文庫進行制備。
　　 5、采用流式細胞術與熒光顯微鏡這兩種方法分別對文庫富集的情況進行監(jiān)測。
　　 結果：
　　 在細胞消減SELEX過程中，我們從第四輪開始加入了消減細胞共進行了七輪的篩選。同時我們采用特殊莖環(huán)引物PCR法對次級文庫進行制備。在非對稱PCR的過程中我們發(fā)現(xiàn)36個循環(huán)數(shù)時目的條帶產量大且雜帶少，以此循環(huán)數(shù)作為最適循環(huán)

7、數(shù)進行PCR擴增，另外，文庫（模板）量適當增加有助于增大目的條帶的產量且使非特異性的產物明顯減少。特殊莖環(huán)引物PCR的擴增效率可指示富集情況，我們在對文庫富集情況進行監(jiān)測時首先采用變性PAGE凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)隨著篩選輪次遞增，目的條帶出現(xiàn)遞減趨勢。同時采用流式細胞術進行鑒定出現(xiàn)同樣結果，隨著篩選進行熒光強度增強，圖形右移越明顯。熒光顯微鏡觀察結果也一致。說明特異識別胰腺癌細胞BxPC-3的適配子正逐漸得到富集。
　　 結論：