SELEX技術(shù)篩選鈣通道特異性核酸適配體及其抗肥大細胞活化的作用.pdf

1、目的和方法:
　　鈣內(nèi)流是肥大細胞活化的充分必要條件。肥大細胞鈣內(nèi)流由鈣釋放激活鈣離子(calcium release activation calcium,CRAC)通道介導。構(gòu)成CRAC功能的兩個蛋白為Orai1和STIM1(stromal interaction molecule1)。阻止肥大細胞鈣內(nèi)流有可能抑制肥大細胞活化從而有可能用于過敏治療。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of liga

2、nd by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選的適配體以其高親和力高特異性,在臨床上顯示了廣泛和潛在的應(yīng)用價值。本研究利用 SELEX技術(shù)篩選針對Orai1蛋白第1膜外區(qū)的核酸適配體,利用IgE介導的肥大細胞系LAD2脫顆粒模型,研究核酸適配體對肥大細胞鈣通道的抑制效應(yīng),探討核酸適配體通過抑制鈣內(nèi)流進而阻止肥大細胞活化的可能性。本研究分為三部分:(1)培養(yǎng)人肥大細胞系LAD2細胞,生物素標記的IgE致敏,

3、1分子鏈霉親和素能結(jié)合4分子生物素,從而發(fā)揮多價抗原的作用,用鏈霉親和素攻擊建立LAD2細胞脫顆粒模型,優(yōu)化IgE最佳致敏濃度,并以組胺和β-氨基己糖苷酶釋放為指標檢測肥大細胞活化效果;(2)通過序列比對確認Orai1蛋白第1膜外區(qū)的11個氨基酸具有Orai1蛋白特異性。針對該Orai1蛋白第1膜外區(qū),采用酶聯(lián)板為篩選介質(zhì)的SELEX技術(shù),從人工合成隨機單鏈DNA文庫中篩選并制備核酸適配體。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測適配體與靶蛋白的特異性結(jié)合

4、及親和力常數(shù)(Kd值);(3)用激光共聚焦顯微鏡觀察核酸適配體對細胞內(nèi)鈣濃度變化的影響,以LAD2細胞脫顆粒模型檢測核酸適配體對肥大細胞過敏介質(zhì)釋放的抑制效果,從而觀察核酸適配體對肥大細胞活化的抑制效應(yīng),探討針對CRAC新靶點抑制過敏反應(yīng)的新機制。
　　結(jié)果:
　　1.建立了人肥大細胞系LAD2細胞的培養(yǎng)體系及其脫顆粒模型:LAD2細胞倍增時間為10天,LAD2細胞染色和電鏡觀察細胞核周圍含有大量大小不等顆粒。在密度為1×1

5、06細胞/mL的培養(yǎng)體系中,優(yōu)化了生物素標記的IgE的致敏濃度為500ng/mL,鏈霉親和素攻擊濃度為1000ng/mL。在優(yōu)化濃度作用下,培養(yǎng)體系中的肥大細胞活化效果最佳。
　　2.SELEX篩選共進行了12輪,各輪產(chǎn)物與Orai1蛋白親和力呈逐漸升高趨勢,于第11輪序列達到最高值。以第11輪富集庫序列為基礎(chǔ)獲得了7條核酸適配體,其中AptamerY1親和力最高。酶聯(lián)免疫吸附試驗證實了AptmerY1可與Oari1特異性結(jié)合。A

6、ptamerY1親和力常數(shù)(Kd值)為1.72×10-8mol/L。
　　3.上述步驟制備的AptamerY1可抑制IgE介導的人肥大細胞系LAD2脫顆粒模型,激光共聚焦顯微鏡觀察AptamerY1明顯抑制了LAD2鈣離子內(nèi)流。AptamerY1對LAD2細胞的β-氨基己糖苷酶釋放抑制率達95％。說明AptamerY1抑制肥大細胞β-氨基己糖苷酶釋放是通過抑制CRAC介導的肥大細胞鈣內(nèi)流所致。
　　主要結(jié)論:
　　建立