CELL-SELEX技術(shù)篩選急性早期幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞適配子.pdf

1、[目的]
　　 利用以細(xì)胞為靶標(biāo)的指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(CELL based Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，CELL-SELEX)技術(shù)，篩選出與急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)NB4活細(xì)胞高親和力高特異性結(jié)合的適配子，為熒光標(biāo)記適配子快速鑒定APL檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　

2、[方法]
　　 1.在體外構(gòu)建兩端為固定序列，中間為40個(gè)m的隨機(jī)序列，全長(zhǎng)76個(gè)nt的單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)，以NB4細(xì)胞作為靶分子，進(jìn)行CELL-SELEX篩選，同時(shí)利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡監(jiān)控FITC-ssDNA次級(jí)庫(kù)與NB4活細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程。
　　 2.從第二輪開始，每輪引入ssDNA次級(jí)庫(kù)與急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)HL60細(xì)胞和慢性髓性白血病(chronic

3、myelogenous leukemia，CML)K562細(xì)胞相結(jié)合的反篩策略。
　　 3.將結(jié)合率(bindingrate，BR)最高的第十六輪篩選產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、純化、TA克隆和測(cè)序，并用Dnaman軟件分析預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 4.用流式細(xì)胞儀測(cè)定克隆適配子群與NB4活細(xì)胞的結(jié)合率，選出結(jié)合率最高的一個(gè)克隆適配子，利用GraphPad.Prism.v4.03軟件進(jìn)行親和力分析。
　　 5.采用TAMRA標(biāo)記

4、結(jié)合率最高的適配子，該適配子與三種白血病細(xì)胞相結(jié)合后，通過(guò)熒光顯微鏡驗(yàn)證其特異性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.隨著篩選輪數(shù)的增加，ssDNA次級(jí)庫(kù)與NB4活細(xì)胞的結(jié)合率逐漸增加，第十六輪的結(jié)合率(19.9％)是第一輪結(jié)合率(1.6％)的12倍；十六輪以后，ssDNA次級(jí)庫(kù)與NB4活細(xì)胞的結(jié)合率不再增加。
　　 2.選取結(jié)合率最高的第十六輪篩選的克隆適配子群進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)21個(gè)克隆適配子序列中有3種不同序列，16個(gè)

5、克隆子序列為：CX1，3個(gè)克隆子序列為：CX5，2個(gè)克隆子序列為：CX9，預(yù)測(cè)分析適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)以莖-環(huán)結(jié)構(gòu)為主。
　　 3.克隆適配子CX1、CX5和CX9分別與NB4活細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)合率分別為：9.7％、12.6％、17.2％；適配子CX9結(jié)合率最高。
　　 4.分析適配子CX9與NB4活細(xì)胞結(jié)合的親和力，其解離常數(shù)(Kd)值低至16.2nM。
　　 5.TAMRA標(biāo)記的適配子CX9與NB