大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs）是目前備受關(guān)注的一類多向分化潛能組織干細(xì)胞，在特定的條件下，MSCs可以跨胚層分化成神經(jīng)細(xì)胞[1]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。多種原因致面神經(jīng)損傷成為口腔頜面部最常見(jiàn)疾病，因神經(jīng)纖維的不可再生性，嚴(yán)重影響疾病治療和患者預(yù)后，成為人們面臨的難題。如何進(jìn)行疾病治療，改善患者預(yù)后是各國(guó)學(xué)者廣泛研究的焦點(diǎn)，

2、人們將眼光投向干細(xì)胞移植治療，細(xì)胞替代治療成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新途徑[2]。本實(shí)驗(yàn)探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)條件，體外定向誘導(dǎo)傳代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化并進(jìn)一步向神經(jīng)紐胞分化，對(duì)分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、選用健康SD大鼠，分離純化并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，通過(guò)免疫表型鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3、

3、貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，分為對(duì)照組和誘導(dǎo)劑組。對(duì)照組中不加誘導(dǎo)劑；誘導(dǎo)劑組分兩步誘導(dǎo)：首先加入不同濃度表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化劑，連續(xù)培養(yǎng)6d；然后應(yīng)用腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和全反式維甲酸繼續(xù)誘導(dǎo)6d，分別收集誘導(dǎo)后第3d、6d、9d的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定和免疫組化鑒定。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、傳代第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為梭形成纖維樣細(xì)胞，均一穩(wěn)定的表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表

4、面抗原標(biāo)記物CD29，CD44，CD90，陽(yáng)性率分別為98.76％，98.41％，96.58％，但極少表達(dá)CD34，CD45。
　　 2、經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）共同誘導(dǎo)6d后，誘導(dǎo)劑組巢蛋白（NESTIN）陽(yáng)性表達(dá)率約為83％，而對(duì)照組細(xì)胞未表達(dá)巢蛋白。
　　 3、經(jīng)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和全反式維甲酸（ATRA）聯(lián)合誘導(dǎo)6d后，誘導(dǎo)劑組均可見(jiàn)微管相關(guān)蛋白2陽(yáng)性細(xì)胞（MAP2

5、），神經(jīng)絲（NF）及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）陽(yáng)性細(xì)胞，大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05），對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)仍為梭形成纖維樣細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、實(shí)驗(yàn)采用改良的全骨髓貼壁法，操作簡(jiǎn)單快速，細(xì)胞活性好，是一種較為理想的分離和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
　　 2、bFGF和EGF兩種預(yù)誘導(dǎo)劑同時(shí)用比bFGF和EGF單一使用效果好。
　　 3、bFGF和EGF

6、聯(lián)合用的3種濃度（50ug/1、100ug/1、150ug/1）中，100ug/1濃度預(yù)誘導(dǎo)效果為最佳，誘導(dǎo)出神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量多。
　　 4、經(jīng)過(guò)ATRA和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，能夠?qū)⒋蟛糠稚窠?jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 5、鑒定細(xì)胞方法多，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，免疫組化和免疫熒光鑒定誘導(dǎo)后神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 6、鑒定細(xì)胞試劑種類多，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CD29、CD90、CD45、CD44