丹酚酸B通過PPAR-γ和LXRα途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞ABCA1依賴的膽固醇流出.pdf

1、研究目的：
　　膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)是機(jī)體排除過多膽固醇的唯一途徑，對(duì)維持生物體膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義，也是目前認(rèn)為機(jī)體對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要機(jī)制之一。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響因素及調(diào)控機(jī)制多而復(fù)雜。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCAl)是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂流出至細(xì)胞外貧脂的ApoAⅠ。ABCA1基因突變的Tangier病患者和ABCA1基因敲除的小鼠均表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流障礙。ABCA1首先

2、介導(dǎo)泡沫細(xì)胞內(nèi)的磷脂流出，磷脂流出后與細(xì)胞外ApoAⅠ結(jié)合，形成盤狀復(fù)合物;在其誘導(dǎo)下，使細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇流出并與該復(fù)合物相結(jié)合，從而形成前β-HDL，接著在卵磷脂膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶作用下，前β-HDL轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腍DL。因此，ABCA1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流關(guān)鍵的限速蛋白，ABCA1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。
　　ABCA1在體內(nèi)的表達(dá)受多個(gè)因素所調(diào)節(jié)，研究較多的是核受體家族，如過氧化物酶體增殖激活型受體(PPA

3、Rs)、肝孤兒受體(LXR)、視黃醇X受體(RXR)等，它們均可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ABCA1的表達(dá)。PPARs包括PPAR-α，PPAR-β和PPAR-γ三種亞型。其中PPAR-γ是核受體家族最重要的成員之一，現(xiàn)在認(rèn)為PPAR-γ參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝和細(xì)胞分化。PPAR-γ作為一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控多個(gè)介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的基因表達(dá)。LXR是核受體超家族成員，有LXRα和LXRβ兩種亞型。LXRα可調(diào)節(jié)肝臟、巨噬細(xì)胞和小腸內(nèi)膽固醇代謝

4、相關(guān)的許多靶基因。研究證實(shí)，LXR激動(dòng)劑可上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出。
　　丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是提取的丹參干燥根及根莖中的有效成分。Sal B為一分子咖啡酸和三分子丹參素縮合而成，是丹參活性最強(qiáng)的水溶性提取物之一，也是研究較多的丹參酚酸。以往的研究已證實(shí)，Sal B能改善血流動(dòng)力學(xué)，降低氧化損傷和修復(fù)血管內(nèi)皮功能。在過去的幾年中Sal B以及其他的丹參提取物質(zhì)在中

5、國(guó)甚至有些西方國(guó)家已廣泛用于動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病包括冠心病和中風(fēng)。Sal B能夠清除羥自由基，超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，因而被視為一種抗氧化劑。Sal B被證實(shí)是一種有效的CD36拮抗劑，抑制巨噬細(xì)胞依賴于CD36對(duì)修飾型低密度脂蛋白的攝取。Sal B能抑制血小板的聚集和活化，通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9穩(wěn)定粥樣斑塊改善預(yù)后。在飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥兔模型中，Sal B能抑制LDL的氧化修飾，降低血漿膽固醇水平，

6、改善內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。
　　上述研究結(jié)果表明，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)被證實(shí)是脂質(zhì)代謝HDL防止動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制。Sal B在脂質(zhì)代謝和抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中扮演了重要角色。然而，目前關(guān)于Sal B對(duì)膽固醇流出影響的研究較少，本研究以PMA誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)Sal B對(duì)膽固醇流出的影響。在蛋白和mRNA水平測(cè)定THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)，及PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表達(dá)。采用PPAR

7、-γ和LXRα激動(dòng)劑及拮抗劑檢測(cè)Sal B誘導(dǎo)的促進(jìn)脂質(zhì)外排過程中的作用，從而澄清Sal B與膽固醇流出的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.THP-1源性巨噬細(xì)胞的培養(yǎng):人THP-1單核細(xì)胞在160nmol/mlPMA作用72h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化生成巨噬細(xì)胞。
　　2.THP-1源性巨噬細(xì)胞在50mg/L ox-LDL和1.0μCi/ml[3H]-膽固醇作用24h，誘導(dǎo)生成負(fù)載膽固醇的巨噬細(xì)胞。<

8、br>　　3.Sal B(0，0.1，1 and10μM)作用于荷脂的THP-1源性巨噬細(xì)胞24h，及10μM Sal B作用于細(xì)胞0、3、6、12、24 h。液體閃爍法測(cè)定放射性物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，評(píng)價(jià)Sal B對(duì)膽固醇流出的影響。
　　4.Sal B作用于THP-1源性巨噬細(xì)胞，Real-time PCR方法檢測(cè)ABCA1 mRNA水平的表達(dá);Western blot方法檢測(cè)ABCA1蛋白水平的變化。
　　5.Sal B作用于

9、THP-1源性巨噬細(xì)胞，Western blot方法檢測(cè)PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表達(dá)。
　　6.PPAR-γ和LXRα激動(dòng)劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于THP-1源性泡沫細(xì)胞24h，Real-time PCR方法檢測(cè)ABCA1 mRNA水平的表達(dá);Western blot方法檢測(cè)ABCA1蛋白水平的變化。
　　7.PPAR-γ和LXRα激動(dòng)劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于荷脂THP-1源性巨噬細(xì)胞24h，測(cè)

10、定膽固醇流出率。
　　研究結(jié)果：
　　1.Sal B對(duì)負(fù)載膽固醇THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出率的影響:在ApoA-Ⅰ，HDL2或HDL3存在情況下，用不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理荷脂的THP-1源性巨噬細(xì)胞24h。與對(duì)照組比，1μM Sal B能促進(jìn)膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2(P＜0.05)，10μM Sal B促進(jìn)膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2約是對(duì)照組2.5倍和3.2倍(P＜0.

11、01)。同時(shí)，10μMSal B也能促進(jìn)膽固醇流出至HDL3(P＜0.05)。
　　10μM Sal B處理負(fù)載膽固醇的THP-1源性巨噬細(xì)胞0、3、6、12、24 h。結(jié)果顯示，6h之內(nèi)Sal B不能發(fā)揮對(duì)膽固醇流出至三種介質(zhì)的作用;12h后Sal B明顯增強(qiáng)膽固醇流出(P＜0.05)，培養(yǎng)24h后可顯著增強(qiáng)膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明Sal B以濃度和時(shí)間依賴模式促進(jìn)THP-1源性

12、巨噬細(xì)胞膽固醇外排至ApoAⅠ、HDL2和HDL3。
　　2.Sal B對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1在蛋白和mRNA水平表達(dá)的影響:不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24h。與對(duì)照組比較，0.1μM Sal B處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后ABCA1蛋白和mRNA水平表達(dá)無明顯改變，而1μM(P＜0.05)和10μM(P＜0.01) Sal B處理后，ABCA1蛋白和mRNA水平表

13、達(dá)均明顯提高。
　　用10μM Sal B處理THP-1巨噬細(xì)胞0、3、6、12、24 h。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10μM Sal B處理3h和6h對(duì)ABCA1蛋白水平表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。10μM Sal B刺激12h和24h ABCA1蛋白水平表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。ABCA1 mRNA水平表達(dá)在10μM Sal B處理達(dá)6h后明顯升高(P＜0.01)。
　　上述結(jié)果表明，Sal B可以濃度和時(shí)間依賴模

14、式增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)。
　　3.Sal B對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPAR-γ和LXRα在蛋白水平表達(dá)的影響:不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞24h。與對(duì)照組比較，1μM和10μM Sal B處理后PPAR-γ和LXRα的表達(dá)顯著增加(P＜0.01);0.1μM SalB處理后PPAR-γ和LXRα的表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。

15、　　4.PPAR-γ和LXRα激動(dòng)劑及拮抗劑對(duì)Sal B誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響:PPAR-γ拮抗劑GW9662(20μM)和LXRα拮抗劑GGPP(5μM)均顯著抑制Sal B誘導(dǎo)的ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)(P＜0.01)，而PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮(1μM)和LXRα激動(dòng)劑GW3965(5μM)大大增強(qiáng)ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)(P＜0.01)。
　　5.PPAR-γ和LXRα激動(dòng)

16、劑及拮抗劑對(duì)Sal B誘導(dǎo)荷脂的THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響:PPAR-γ和LXRα激動(dòng)劑及拮抗劑分別與SalB共同孵育負(fù)載膽固醇的THP-1源性巨噬細(xì)胞24h。與對(duì)照組比較，SalB顯著促進(jìn)膽固醇流出至ApoAⅠ(P＜0.01)、HDL2(P＜0.01)和HDL3(P＜0.05)。PPAR-γ拮抗劑GW9662和LXRα拮抗劑GGPP均明顯抑制Sal B誘導(dǎo)的膽固醇流出(P＜0.01)。PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮和LXRα激

17、動(dòng)劑GW3965均明顯增強(qiáng)Sal B誘導(dǎo)膽固醇流向ApoAⅠ、HDL2和HDL3(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論：
　　1.Sal B可以時(shí)間和濃度依賴模式促進(jìn)體外培養(yǎng)的負(fù)載膽固醇的THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出。
　　2.Sal B可以濃度和時(shí)間依賴模式增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)。
　　3.Sal B促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)是通過PPAR-γ和LXRα途徑。