惡性膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞體外三維成型特性和諾帝抑制作用的研究.pdf

1、在腫瘤組織微環(huán)境中內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及管型的形成構(gòu)成了實體瘤血管生成的基本過程，抗血管生成的研究是目前腫瘤學(xué)研究的熱點之一。惡性膠質(zhì)瘤血管生成極其活躍，血管內(nèi)皮細胞增生隨惡性程度增加而增加，因此深入研究膠質(zhì)瘤血管生成機制對于揭示腫瘤血管生成的機理具有重要的意義。脂氧化酶抑制劑去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)是從常青灌木Larreadivaricata和Guaiacumoffrcinale中

2、提取的一種天然成分，具有多種生物學(xué)功能，尤其是在抗腫瘤治療的作用倍受人們的關(guān)注。我們根據(jù)NDGA的化學(xué)結(jié)構(gòu)自行合成了其制劑諾帝，并發(fā)現(xiàn)它不但具有顯著的抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，抑制bFGF的表達的作用，而且能減低移植瘤和實驗性膠質(zhì)瘤的微血管密度，但其機理尚不十分清楚。本研究旨在通過建立體外小管樣結(jié)構(gòu)的形成模型，并在此模型中研究、探討諾帝對人惡性膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)血管生成及抑制作用的機理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.以膠原作基

3、質(zhì)、以惡性膠質(zhì)瘤細胞為誘導(dǎo)，構(gòu)建了內(nèi)皮細胞體外三維成型模型并研究了其特性 將內(nèi)皮細胞系ECV304接種于鼠尾膠原作基質(zhì)的培養(yǎng)基上，并以惡性膠質(zhì)瘤細胞系SHG-44培養(yǎng)上清為誘導(dǎo)物，建立了惡性膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞體外三維成型模型；對比觀測了誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)情況下(三維培養(yǎng)組)內(nèi)皮細胞小管樣結(jié)構(gòu)形成情況，并定量檢測管型各種參數(shù)。結(jié)果顯示，ECV304細胞呈現(xiàn)FVIIIRAg和CD34陽性表達；誘導(dǎo)組內(nèi)皮細胞通過芽生、連接和相互圍繞

4、形成小管樣結(jié)構(gòu)；形成管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量從2d開始分別是(2.5±1.0，6±1.63，12.4±3.42，15.5±1.92，19±2.58，23±2.0，27±2.52)明顯多于培養(yǎng)組(0，1.5±0.4，2.5±0.8，4.1±1.13，6.5±1.5，7.6±2.4，9±2.77)，P＜0.01，而且管型形成時間早而快。誘導(dǎo)組內(nèi)皮細胞形成的管樣結(jié)構(gòu)管外徑(602.45±47.93)、管腔內(nèi)徑(412.76±51.85)以及管長度(76

5、8.82±146.28)都顯著大于三維培養(yǎng)組(452.23±43.55，226.35±34.26，368.25±35.26)，P＜0.01。 上述結(jié)果提示，惡性膠質(zhì)瘤細胞的體外分泌物具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞形成小管樣結(jié)構(gòu)的作用，在本模型環(huán)境中內(nèi)皮細胞能較好地模擬體內(nèi)膠質(zhì)瘤微環(huán)境的血管生成過程，是膠質(zhì)瘤血管生成研究的良好的體外模型。 2.以惡性膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞三維成型為模型，觀測了諾帝對體外血管生成的抑制作用 利用上

6、述試驗?zāi)Ｐ停圆煌瑵舛戎Z帝為試驗藥物，觀測了諾帝對內(nèi)皮細胞ECV304增殖活性(細胞生長曲線、存活率、抑制率、核分裂指數(shù)、核面積、核/漿面積比)、細胞周期、小管樣結(jié)構(gòu)形成以及管型參數(shù)的影響。結(jié)果顯示，50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L的諾帝對內(nèi)皮細胞存活率有明顯的抑制作用，抑制率分別為14.53±5.59、31.33±5.76、31.59±6.93、35.53±8.79，各組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意

7、義(P＜0.01)。其中，100μmol/L組在抑制程度上明顯大于50μmol/L組，而100μmol/L以上不同濃度在抑制程度上無明顯差別(P＞0.05)。諾帝對內(nèi)皮細胞核分裂指數(shù)、核面積和核/漿面積比也有顯著影響(P＜0.01)。結(jié)果提示，不同濃度諾帝對細胞的增殖有明顯的抑制作用。流式細胞分析結(jié)果顯示，諾帝組細胞進入S期、G2/M期分裂期的細胞明顯減少，細胞增殖周期被阻滯在G0/G1期，凋亡發(fā)生率占4.91％，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(

8、P＜0.01)。說明諾帝對細胞增殖的抑制作用是通過改變細胞周期，誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)的。 內(nèi)皮細胞成型實驗顯示，不同濃度諾帝對小管樣結(jié)構(gòu)的形成都有不同程度的抑制作用。6d時，誘導(dǎo)組小管數(shù)12.4±3.42條，50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L諾帝組分別是7.5±1.00、7±2.00、7.5±1.00、9±1.16條，兩組差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。諾帝對惡性膠質(zhì)瘤細胞誘導(dǎo)的小管

9、樣結(jié)構(gòu)在管外徑、管腔及管長度(三個參數(shù)分別為164.91±40.02、73.81±22.58、306.00±93.66)上與誘導(dǎo)組相比有明顯的抑制作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。上述結(jié)果提示，諾帝對內(nèi)皮細胞體外成型有明顯的抑制作用 3.諾帝在抑制內(nèi)皮細胞三維成型時VEGF受體flt-1和flk-1表達的變化采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測了上述實驗各組內(nèi)皮細胞兩種VEGF受體flt-1和flk-1的表達及其與三維成型受抑的關(guān)

10、系。結(jié)果顯示，在小管樣結(jié)構(gòu)形成的初期，形成突起部位flt-1和flk-1明顯的高表達，flt-1和flk-1的表達分別為211.4329±16.3739和257.24±17.8451，而周圍部位flt-1和flk-1的表達分別為153.8783±2.4337和146.3932±3.8172，具有部位分布的差異性(P＜0.01)。諾帝對內(nèi)皮細胞flt-1和flk-1的表達在各時相點都有一定的抑制作用(P＜0.01)，并與小管樣結(jié)構(gòu)形成受抑