諾帝抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)趨化因子和生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng).pdf

1、快速增殖、高度侵襲和活躍的血管生成是腦惡性膠質(zhì)瘤的重要生物學(xué)特性，其結(jié)果是嚴(yán)重破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能并常因腫瘤占位而致死。盡管近二十年來(lái)的惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)、化療、放療甚至基因治療等多種治療措施有明顯進(jìn)步，但是并未能很好地延長(zhǎng)病人的生存期。因此，如同其它腫瘤一樣，探尋惡性膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)和治療方法十分必要和重要。 本課題研究小組近來(lái)發(fā)現(xiàn)，G-蛋白偶聯(lián)受體家族中甲酰化肽受體(formylpeptidereceptor，F(xiàn)PR)

2、在惡性膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，且與腫瘤級(jí)別和微血管密度有密切關(guān)系，即它具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的新功能。細(xì)菌源性多肽如N-甲?；琢蝓?亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF)和一些宿主源性的多肽如來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或其它宿主細(xì)胞線粒體的一些多肽，均能與FPR結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的遷移和增殖。這一結(jié)果提示FPR類(lèi)似于傳統(tǒng)的生長(zhǎng)因子受體，可能是腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

3、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)是一種天然的脂氧化酶抑制劑。我們以前的研究結(jié)果表明，NDGA能抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)并能促進(jìn)其分化。我們基于天然NDGA的結(jié)構(gòu)，合成了其手性化合物諾帝(Nordy)。研究發(fā)現(xiàn)，諾帝具有強(qiáng)烈的抗癌效應(yīng)。 鑒于惡性膠質(zhì)瘤中FPR功能意義尚需進(jìn)一步明確，諾帝抗腫瘤機(jī)制是否涉及FPR介導(dǎo)的血管生成作用亦未認(rèn)識(shí)，本課題對(duì)此進(jìn)行了研究。首先，我們觀測(cè)了三種常用膠質(zhì)瘤細(xì)胞

4、系中FPR的表達(dá)及其與細(xì)胞分化之間的關(guān)系，并觀察了諾帝對(duì)這種表達(dá)的影響；然后，重點(diǎn)研究了人源性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87上FPR的功能活性即該受體活化后細(xì)胞增殖、遷移、[Ca2+]i變化和上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的產(chǎn)生，以及諾帝對(duì)FPR這種功能活性和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用；最后，

5、我們研究了上述過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)分子功能狀態(tài)(磷酸化水平)的變化。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下： 1.采用定量免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和vimentin為膠質(zhì)瘤分化標(biāo)記物，定量觀測(cè)了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和BT325及大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6的FPR表達(dá)，結(jié)果顯示，三種細(xì)胞系均表達(dá)有FPR蛋白，分化程度最低的U87細(xì)胞FPR表達(dá)最高，提示FPR與膠質(zhì)瘤分化有關(guān)。1

6、00μM諾帝處理后三種細(xì)胞的上述FPR表達(dá)降低(P＜0.05)，但RT-PCR檢測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)FPRmRNA表達(dá)下降(U87細(xì)胞)。 2.以U87細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，以fMLF(100nM)和合成的W-肽(100nM)作為FPR的激動(dòng)劑，以EGF(10ng/ml)作為EGFR的刺激物，采用48孔趨化小室進(jìn)行細(xì)胞趨化遷移實(shí)驗(yàn)、記數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖、Fura-2AM作指示劑測(cè)定細(xì)胞的鈣動(dòng)員、RT-PCR測(cè)定VEGFmRNA表達(dá)和ELISA法

7、檢測(cè)VEGF分泌水平，評(píng)估了U87細(xì)胞FPR的功能和諾帝(25，50和100μM)對(duì)這些功能反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示： (1)fMLF或EGF均能顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖，25μM諾帝未能顯著地影響U87細(xì)胞的增殖，但50和100μM諾帝顯著地抑制由fMLF或EGF誘導(dǎo)的U87細(xì)胞的增殖。 (2)fMLF，W-肽或EGF可以非常顯著地引起U87細(xì)胞的趨化遷移，50和l00μM的諾帝可以抑制此趨化作用。 (3)fMLF和W-

8、肽均以濃度依賴(lài)性形式激發(fā)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的產(chǎn)生，諾帝處理后經(jīng)上述刺激，鈣內(nèi)流的變化呈現(xiàn)為雙相，即當(dāng)?shù)蜐舛?低于25μM)諾帝處理，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i增強(qiáng)，而高濃度(50μM以上)諾帝處理，[Ca2+]i被抑制。 (4)fMLF刺激FPR后能上調(diào)VEGFmRNA表達(dá)和VEGF蛋白分泌水平，并呈濃度依賴(lài)性；諾帝顯著降低了fMLF引起的VEGFmRNA表達(dá)和蛋白分泌水平的增高。 3.以U87細(xì)胞為試驗(yàn)材料，以fMLF和E

9、GF分別激活FPR和EGFR兩受體，以諾帝為處理藥物，采用Westernblot方法對(duì)細(xì)胞信號(hào)分子MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt、IкB和EGFR(Try992)及EGFR(Try845)的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，fMLF可以快速而短暫地誘導(dǎo)MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt及IrB的磷酸化。高劑量(50、100μM)諾帝可以顯著削弱此效應(yīng)，并呈劑量依賴(lài)性。EGF也以快速而短暫地誘導(dǎo)EGFR(Try992

10、)和EGFR(Try845)的磷酸化，此磷酸化水平被高劑量(100μM)的諾帝所抑制。 上述結(jié)果提示，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同程度地表達(dá)FPR，并與細(xì)胞分化程度相關(guān)；表達(dá)于U87細(xì)胞的FPR激活后具有多重效應(yīng)(功能)，包括促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖、遷移、Ca2+流動(dòng)和VEGF的產(chǎn)生，而諾帝明顯抑制FPR的表達(dá)和功能效應(yīng)；諾帝對(duì)MAPKs、Akt、IкB和EGFR蛋白磷酸化水平和鈣動(dòng)員的抑制作用可能是其抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管生成重要分