10388.無選擇標(biāo)記基因修飾細胞模型的構(gòu)建與評價

1、分類號密級UDC編號碩士學(xué)位論文無選擇標(biāo)記基因修飾細胞模型的構(gòu)建與評價無選擇標(biāo)記基因修飾細胞模型的構(gòu)建與評價學(xué)位申請人：人：王志蕊王志蕊指導(dǎo)教師：師：董發(fā)明董發(fā)明教授教授畢延震畢延震研究員研究員學(xué)科專業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)位類別：別：理學(xué)理學(xué)2014年5月摘要I論文題目：論文題目：無選擇標(biāo)記基因修飾細胞模型的構(gòu)建與評價無選擇標(biāo)記基因修飾細胞模型的構(gòu)建與評價專業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究

2、生：生：王志蕊王志蕊指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：董發(fā)明董發(fā)明教授教授畢延震畢延震研究員研究員摘要本研究通過用豬腎PK15細胞作為細胞模型，分別構(gòu)建了功能性MSTN打靶載體和TALEN效應(yīng)蛋白表達載體，經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染法將打靶載體導(dǎo)入豬腎PK15細胞，篩選獲得了一個能穩(wěn)定整合該載體、且EGFP表達均一的單克隆細胞。然后針對打靶載體ΔMSTN上錨定的LoxP位點，設(shè)計Cre重組酶表達載體(pTurboCre)，在MSTN打靶載體與TALEN表達載體轉(zhuǎn)入

3、豬腎PK15細胞，并篩選得到MSTN基因敲除單克隆細胞后，用CreLoxP重組系統(tǒng)敲除選擇標(biāo)記基因，評價該系統(tǒng)的基因刪除效率及定點置換率，為基因重組技術(shù)的研究利用提供新策略。通過流式篩選分析（FACS）、熒光定量PCR、TA克隆與測序等手段驗證CreLoxP重組系統(tǒng)在豬細胞內(nèi)介導(dǎo)內(nèi)源性選擇標(biāo)記基因的刪除效率，并取得了以下研究結(jié)果：1.通過篩選得到了單克隆細胞系，這也驗證了選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和EGFP表達的有效性；在獲得單克隆細胞系

4、的基礎(chǔ)上通過CreLoxP介導(dǎo)的位點特異重組，驗證了刪除內(nèi)源性選擇標(biāo)記表達框的可行性與效能。該單克隆細胞系的獲得，證明了打靶載體上的選擇標(biāo)記基因能夠有效表達，從而為檢測刪除反應(yīng)提供了一個良好的細胞模型。2.通過流式細胞儀測定各組總熒光表達強度GFPAMean水平。結(jié)果顯示，空白組Mock與陰性對照組Neg.Ctrl熒光峰值、峰形相當(dāng)，無明顯變化；CreloxP組熒光峰形變窄，熒光強度下降比較明顯。對各組熒光表達變化差異的分析結(jié)果顯示，C