基因修飾的人羊水祖細胞宮內(nèi)移植小鼠模型的研究.pdf

1、血友病 B是由凝血因子 IX（FIX）缺乏所引起的 X連鎖隱性遺傳性出血疾病，需終生治療，且費用昂貴，因此人們希望通過基因治療來改善患者的癥狀。hFIX的表達不需要精確地調(diào)控,少量提高即可改善患者的出血癥狀,凝血因子的分泌無臟器特異性，因此血友病長期以來被認為是一種適合基因治療的疾病。
　　多數(shù)針對出生后的個體的基因治療，效果不佳，大多在短期內(nèi)FIX的表達就下降了。近年來的研究表明，干細胞宮內(nèi)移植（In Utero Stem Ce

2、ll Transplantation，IUSCT）是克服移植免疫排斥反應(yīng)的一種有效途徑。在胎兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟時，通過宮內(nèi)注射的方法將干細胞輸入到胎兒體內(nèi)，使干細胞能在受體體內(nèi)歸巢并增殖分化，從而達到治療疾病的目的。干細胞作為基因的一種載體是研究的熱點之一，胚胎干細胞最具全能性，但由于倫理上的爭議限制了其使用。
　　人們在羊水中發(fā)現(xiàn)了具有干性的胎兒細胞，這些細胞具有類似胚胎干細胞的功能，而沒有研究胚胎干細胞的倫理問題。為了使

3、羊水細胞宮內(nèi)移植能應(yīng)用到臨床實踐，首先需在動物體內(nèi)進行宮內(nèi)治療的實驗研究，通過建立羊水干細胞嵌合體動物模型來探討干細胞在體內(nèi)的各種生物學特征和功能，為宮內(nèi)治療的實施奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　首先，我們通過富含各種生長因子的培養(yǎng)液篩選貼壁的羊水細胞，再用機械分離的方法得到形態(tài)均一的羊水祖細胞(hAFPC)，這種細胞呈長梭形，增殖速度快，并表達NANOG，SOX2，SSEA4和 TRA1-60等胚胎干細胞的特異性蛋白，經(jīng)誘導(dǎo)能成脂肪分

4、化和成骨分化。接著，我們構(gòu)建了hFIX和GFP共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，以慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染了羊水祖細胞后使用流逝細胞儀篩選出 GFP陽性的細胞，進一步培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，羊水細胞能夠在mRNA水平表達hFIX和GFP,并且在細胞上清液中檢測到了持續(xù)穩(wěn)定表達的FIX蛋白，以及與之相應(yīng)的FIX活性。由此我們證實羊水祖細胞轉(zhuǎn)染了hFIX片段后能夠持續(xù)合成有凝血活性的 hFIX。應(yīng)用改良的宮內(nèi)移植注射器，我們將這種基因修飾的羊水祖細胞移植到12.5d的胎鼠腹腔中，嵌

5、合率達到50％以上。移植的細胞主要歸巢到小鼠的肝臟和脂肪組織，其中肝臟中外源細胞的含量可達55.71±21.02%。出生3個月后仍能檢測到外源基因的表達。受體小鼠的外周血中我們也檢測到了高于1%的hFIX濃度，同樣可持續(xù)到出生后3個月。本研究為羊水來源的干細胞應(yīng)用于血友病B的產(chǎn)前治療提供了實驗基礎(chǔ)，也為宮內(nèi)治療遺傳性疾病提供新的途徑。轉(zhuǎn)染了hFIX基因的羊水祖細胞可能成為血友病B基因治療的新型細胞來源
　　本研究建立了分離和培養(yǎng)羊