APC基因沉默與TGF-β對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞粘附作用的相關(guān)性分析.pdf

1、目的：
　　 惡性腫瘤細(xì)胞粘附作用的減弱和缺失是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，而轉(zhuǎn)移是腫瘤所致死亡的主要原因之一。而E-cadherin是上皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附作用的主要調(diào)節(jié)因子。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人類(lèi)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著廣泛的作用。了解TGF-β通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展的特定環(huán)節(jié)中的不同作用，對(duì)遺傳性結(jié)直腸癌的認(rèn)識(shí)和干預(yù)提供了新的機(jī)會(huì)。WNT通路是迄今研究密度最大的通路之一，它在胚胎與腫瘤中的作用備受矚目，而其中的Wnts、APC

2、、axin和TCFs等都與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。
　　 本研究將主要關(guān)注兩個(gè)通路在人結(jié)直腸癌細(xì)胞的粘附中的作用，并探討其可能存在的交叉調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：
　　 APC-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：使用Ambion公司的在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)并合成能夠編碼針對(duì)APC基因的小發(fā)夾RNA（APC-shRNA）的寡核苷酸鏈模板，將其插入到pSliencerTM 4.1-CMV neo表達(dá)質(zhì)粒載體中，形成pSliencerT

3、M 4.1-CMV-APC-shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒；應(yīng)用感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α擴(kuò)增該重組表達(dá)質(zhì)粒，利用質(zhì)粒的氨芐青霉素抗藥性篩選出成功轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)增；應(yīng)用RT-PCR及基因測(cè)序方法篩選出插入APC-shRNA堿基序列無(wú)突變的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增純化。建立HCT-116-APC-RNAi細(xì)胞模型：應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR及western blot檢測(cè)APC

4、基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，確認(rèn)APC基因沉默。分別采用RT-PCR法和western blot檢測(cè)APC基因沉默前后E-cadherin表達(dá)的變化；用Transwell法檢測(cè)APC基因沉默前后細(xì)胞侵襲水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建APC-shRNA表達(dá)質(zhì)粒：含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌液PCR擴(kuò)增片段大小約為250bp，并且其基因測(cè)序結(jié)果顯示插入片段堿基排列順序正確，沒(méi)有突變，說(shuō)明APC-shRNA表達(dá)質(zhì)粒

5、構(gòu)建成功；且EGFP證明轉(zhuǎn)染效率約為70～80％，說(shuō)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系有效。
　　 2、成功建立HCT-116-APC-RNAi細(xì)胞模型：與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染APC-shRNA質(zhì)粒后48和72小時(shí)，APC基因mRNA表達(dá)水平均明顯減低，表達(dá)抑制率分別為63.31±6.84％、77.03±5.61％（P<0.05）。在蛋白水平，APC蛋白在轉(zhuǎn)染后的48與72小時(shí)后，抑制率為73.03±9.33％和79.51±10.13％（P<0.0

6、5）。說(shuō)明APC基因沉默，HCT-116-APC-RNAi細(xì)胞模型成功建立。
　　 3、APC基因沉默對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-116中TGF-β誘導(dǎo)E-cadherin作用的影響：與陰性對(duì)照組相比，APC基因沉默可抑制HCT-116細(xì)胞中E-cadherin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，轉(zhuǎn)染后48與72小時(shí)后，mRNA與蛋白抑制率為66.35±3.65％、71.32±4.57％（P<0.05）。在蛋白水平，E-cadherin抑制率為71.10±5

7、.76％和77.54±9.16％（P<0.05）。差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、APC基因沉默對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞侵襲性的影響：與陰性對(duì)照組相比，APC基因沉默后，Transwell可見(jiàn)TGF-β對(duì)HCT-116侵襲的作用從抑制變化為促進(jìn)。在對(duì)照組HCT-116細(xì)胞中，給予10ng/ml TGF-β1可以抑制約16.6％的腫瘤細(xì)胞，但是在APC沉默的HCT-116細(xì)胞中則刺激了約13.2％的腫瘤細(xì)胞侵襲。