單克隆抗體制備過程注射抗原b淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合

1、抗體工程制藥,2011年6月,第一節(jié) 概述第二節(jié) 單克隆抗體第三節(jié) 基因工程抗體第四節(jié) 噬菌體抗體工程第五節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)抗體第六節(jié) 抗體工程在制藥功業(yè)上的應(yīng)用,第一節(jié) 概 述,一、抗體定義,抗體（antibody，Ab）： 指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白,Ig,Ab,化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念,生物學(xué)功能上的概念,,,

2、,,,,二、抗體工程發(fā)展歷程,1890年，Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年， Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（ β ）球蛋白、丙種（ γ ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，Köhler and Milstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出 McAb. 在臨床上主要用于診斷和治療。1984年報道了人—鼠嵌合抗體,多克隆抗體,單克

3、隆抗體,基因工程抗體,整體水平抗體生成技術(shù),細(xì)胞工程抗體生成技術(shù),基因工程抗體生成技術(shù),,,多克隆抗體（抗血清）,單克隆抗體,嵌合抗體、改形抗體,“小型化抗體”（單鏈抗體）,組合抗體庫技術(shù),噬菌體抗體庫技術(shù),Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠,抗體真核表達(dá)技術(shù),三、抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能,1、酶解片段,(1)Fab段　2個　抗原結(jié)合片段 　　 fragment with antigen binding (2)Fc段　 1個　可結(jié)

4、晶片段 　　 fragment crystallized,（1）Porter　 木瓜蛋白酶,(1)F(ab’)2 段 1個 結(jié)合顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng) (2)Fc’段　 1個 無生物學(xué)活性,（2）Nisonoff 胃蛋白酶,（1）、輕鏈（light chain，L鏈）　　　　214個氨基酸殘基，24

5、KD。　　　　分為：κ與λ　2個亞型。,（2）、重鏈（heavy chain，H鏈）　　450-550個氨基酸殘基，55-75KD。分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈?！　　　gM，IgG，IgA，IgD，IgE。,2、重鏈和輕鏈,3、可變區(qū)和恒定區(qū),（1）可變區(qū)（Variable region，V區(qū)）　　L鏈N端 1/2處（VL）110個aa;　　H鏈N端1/5-1/4處（VH）118個aa。,互補(bǔ)決定區(qū)（complemen

6、tarity-determining 　　　　　　region, CDR），HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3,（2）恒定區(qū)（constant region，C區(qū)）　　L鏈C端1/2處，105個aa; H鏈C端3/4-4/5處，331-431個aa。,在同一種屬動物中是比較恒定的,是制備第二抗體進(jìn)行標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。,4、功能區(qū),鏈內(nèi)二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為功能區(qū)，約由110個aa組成。,（1）L

7、鏈：2個，VL，CL各1,（2）H鏈：　　IgG，IgA，IgD：4個（V區(qū)1個，C區(qū)3個） 　　IgM，IgE：5個（V區(qū)1個，C區(qū)4個）,（3）功能區(qū)的作用：,（a）VL和VH：結(jié)合抗原決定簇（FV區(qū)）,（b）CL和CH：具有同種異型的遺傳標(biāo)記,（c）CH2：結(jié)合補(bǔ)體,（d）CH3：結(jié)合Fc受體　　單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞，　　NK細(xì)胞,C+V2Fab+FcF(ab’)2+ Fc’,V= FR+ HVR=FR+

8、CDRC=CL+CH1+CH2+CH3,Ab=,,,,,,CDR1,CDR2,CDR3,第二節(jié) 單克隆抗體,McAb是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。,一、單克隆抗體制備過程,,,,,,,,,,,,,,,,,,注射抗原,,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,細(xì)胞融合、篩選,雜

9、交瘤細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng),篩選，繼續(xù)培養(yǎng),足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,體外培養(yǎng),（注射到小鼠腹腔）,體內(nèi)培養(yǎng),單克隆抗體,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,,,所有抗體混合,1,2,3,4,,,,脾 臟,淋巴結(jié),B 細(xì)胞,多克隆抗體制備過程,1,2,3,4,1,2,3,4,單抗,細(xì)胞融合,取出脾細(xì)胞,,,+癌細(xì)胞,各抗體分開,單克隆抗體制備過程,1、抗原與動物免疫,抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動物：BALB/c小鼠或Lou大鼠免

10、疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫,2、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng),基本方法：取適量脾細(xì)胞（1*108）與骨髓瘤細(xì)胞（2*107~3*107）進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋,用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點。 PEG的相對分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。

11、常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。相對分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時間。,（1）細(xì)胞融合液中的細(xì)胞類型：4或5種。（2）如何去除脾-瘤以外的融和細(xì)胞？,HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷

12、DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA,,HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻 雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖；利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA,3、篩選陽性克隆與克隆化,常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。,

13、有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細(xì)胞。第一次克隆化時也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培養(yǎng)液。,軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。,4、單抗檢測,RIA（放射免疫測定）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）FACS（流式細(xì)胞儀）IFA（間接免疫熒光法）,配制方案：雜交瘤細(xì)

14、胞（（1～5）x106/ml) + 細(xì)胞凍存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO )“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇,5、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,細(xì)胞冷凍的意義：,防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞密度過高而死亡,經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時凍

15、存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。,6、單克隆抗體的大量制備,可獲得10µg/ml的抗體。多采用RPMI 1640培養(yǎng)液，添加10%~20%胎?；蛐∨Ｑ?。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100µg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞的生長

16、。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可2*107/ml, 收集的單克隆抗體可達(dá)400 µg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細(xì)胞密度可達(dá)108。,（1）體外培養(yǎng)法：,基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1

17、*106雜交瘤細(xì)胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株。缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。,（2）動物體內(nèi)誘生法,可獲得10µm/ml的抗體。常用方法。,腹腔注射法,7、單克隆抗體的純化,根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法：,體外診斷試劑Ig

18、G類-----沉淀處理+親和層析,IgM類------沉淀處理+凝膠過濾,體內(nèi)診斷試劑或治療用藥-----親和層析+陰離子交換層析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。,鹽析沉淀親和層析離子交換層析,McAb的純化,8、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定,Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示 表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競 爭抑制

19、法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用western blot,單克隆抗體的特性,高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性,A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h，維持有效藥

20、物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。,McAb 在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題（障礙）：,A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質(zhì)量,需要解決的問題：,解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù),1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/8

21、0~1/3。,優(yōu)點 ：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療,單克隆抗體的優(yōu)點與局限性,局限性 ：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費時費工、價格較高,第三節(jié) 基因工程抗體,基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 指用

22、基因工程方法，對抗體的基因進(jìn)行重組、缺失、修飾改型等，構(gòu)建載體，在受體細(xì)胞中表達(dá)，獲得抗體。,將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體,一、人源化抗體,鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理,目的：一是降低免疫源性； 二是降低相對分子量，增加組織通透性,原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。在基因水平上把鼠源性單

23、克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)出完整的嵌合抗體.,人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。方法： 將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。 特點：

24、減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力,（一）嵌合抗體,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,（二）改型抗體,經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變,結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表

25、面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。,定點突

26、變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。 研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。,Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段單域抗體最小識別單位,二、小分子抗體,分子量較小但具有抗

27、原結(jié)合功能的分子片段。基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質(zhì)量僅為原抗體1/80~1/3。,,,,,,,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,,,,Fab,,,,,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。,(1)Fab,,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,,Fv,

28、,,ScFv,連接肽,,Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)

29、域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小識別單位,,CDR,,,可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。,小分子抗體的優(yōu)點及應(yīng)用,應(yīng)用：

30、用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療,優(yōu)點：,三、雙特異性抗體和多價抗體,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。 即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模

31、擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。表達(dá)后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比

32、,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。,分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。,化學(xué)交聯(lián)BsAb,將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。

33、但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費時費力，臨床應(yīng)用時存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。,細(xì)胞工程BsAb,多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,從廣義講應(yīng)屬于雙功能抗體范疇。,（1）配基—配基型融合蛋白，

34、如 CD4-Fcγ.（2）配基—Ig型嵌合抗體，如 IL-2-Ig（3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）,四、抗體融合蛋白,第四節(jié) 噬菌體抗體工程,它是在PCR技術(shù)和Phage Display的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀

35、噬菌體，抗體分子通過與P Ⅲ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。,噬菌體抗體庫技術(shù),1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface dis

36、play system ),用PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段?？贵w庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機(jī)組合 人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人,（一）基本原理和程序,,,,噬菌體抗體庫,（二）噬菌體表面展示文

37、庫技術(shù)的要點,外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段,,,,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。,,篩選到

38、的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，,,,（三）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點,1、模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細(xì)胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性。,2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)

39、 由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細(xì)胞融合技術(shù)。,3、可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。,將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定

40、、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。,該項技術(shù)的優(yōu)點:,噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細(xì)胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細(xì)胞的成熟過程，從而在實際應(yīng)用上具有很大意義。,原核細(xì)胞表達(dá)：真核細(xì)胞表達(dá)：酵母、昆蟲細(xì)胞、中國倉鼠卵細(xì)胞、真菌等。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)：煙草葉和擬南芥植物

41、。其產(chǎn)量可達(dá)葉片總蛋白量的1.3%。轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)：單基因水平上做轉(zhuǎn)基因鼠。,基因工程抗體的表達(dá),第五節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)抗體,獲取人Ig基因：構(gòu)建人Ig的YAC文庫及篩選,小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng),小鼠內(nèi)源性Ig基因的敲除,獲得完整人Ig-YACs克隆,Ig-YACs克隆小ES細(xì)胞的導(dǎo)入,含人Ig-YACs的ES細(xì)胞移入小鼠胚胎,含人Ig-YACs的ES細(xì)胞的小鼠胚胎向小鼠體內(nèi)送還嵌合,純合小鼠的產(chǎn)生和鑒定,純合小鼠制備特異性完全人源化抗體

42、,第六節(jié) 抗體診斷試劑和抗體藥物,抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈現(xiàn)某種反應(yīng)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應(yīng)條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學(xué)診斷和血型測定，稱為血清學(xué)鑒定?？贵w診斷藥物基本分為三類：血清學(xué)鑒定用的和免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體制劑，以及體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。,一、抗體診斷試劑,1、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑,（1）鑒

43、定病原菌用的抗體試劑,直接凝集反應(yīng),（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑,（3）妊娠診斷試劑,婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內(nèi)可達(dá)到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。,（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清,2、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑,給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進(jìn)行定性定量測定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可

44、對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供手段。,（1）熒光抗體診斷試劑,熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。,酶標(biāo)診斷試劑a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標(biāo)診斷試劑b、HBeAg(乙型肝炎

45、e抗原)酶標(biāo)診斷試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標(biāo)診斷試劑d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)診斷試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診斷試劑f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診斷試劑,（2）免疫酶抗體診斷試劑：,把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。,（3）放射免疫用抗體診斷試劑,常用的標(biāo)記抗體試劑：a、 HBsAg放射性核素標(biāo)記抗

46、體診斷試劑：125I 標(biāo)記，靈敏度0.1 ng/mlb、HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125I 標(biāo)記，靈敏度0.1 ng/mlc、HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125I 標(biāo)記d、 AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125I 標(biāo)記，靈敏度1~5 ng/mle、 CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125I 標(biāo)記，靈敏度1 ng/ml,3、導(dǎo)向診斷藥物 由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導(dǎo)

47、向藥物還未愛臨床廣泛應(yīng)用。,二、抗體治療藥物,以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物的研究已有20多年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤相關(guān)的抗原，受試病人超過數(shù)千例。但治療用的制劑尚沒有一種達(dá)到商品化的程度。在治療藥物中，單克隆抗體與毒素的偶聯(lián)物治療淋巴瘤效果最佳，但有效率僅30%,目前的客觀現(xiàn)實是：研究進(jìn)展迅速，但未達(dá)到常規(guī)治療的應(yīng)用階段。障礙（原因）：抗體相對分子質(zhì)量大，穿透力低，不能達(dá)到靶部位或攝取量低。鼠源性抗體的排斥

48、反應(yīng)。,常用的抗癌藥物：氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM) 絲裂霉素(mitomycin,MMC）、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX) 、新抑癌蛋白(neocarzinostatin, NCS) 、正定霉素(doxorubicin, DOX)等。,小結(jié),雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì) 胞與具有在體外不

49、斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一 體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長，經(jīng)過反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選和單個細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤 細(xì)胞系，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。,20世紀(jì)80年代誕生了應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對編碼抗體基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體，

50、稱為基因工程抗體，它具有如下優(yōu)點：①通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)；②基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；③根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；④可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)形式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低了生產(chǎn)成本。,雜交瘤技術(shù)是如何問世的？其基本原理是什么？什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？雜交瘤細(xì)胞的克隆方法