單克隆抗體制備過程注射抗原b淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合

1、抗體工程制藥,2011年6月,第一節(jié) 概述第二節(jié) 單克隆抗體第三節(jié) 基因工程抗體第四節(jié) 噬菌體抗體工程第五節(jié) 轉基因動物表達抗體第六節(jié) 抗體工程在制藥功業(yè)上的應用,第一節(jié) 概 述,一、抗體定義,抗體（antibody，Ab）： 指能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白,Ig,Ab,化學結構上的概念,生物學功能上的概念,,,

2、,,,,二、抗體工程發(fā)展歷程,1890年，Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年， Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（ β ）球蛋白、丙種（ γ ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，Köhler and Milstein等首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出 McAb. 在臨床上主要用于診斷和治療。1984年報道了人—鼠嵌合抗體,多克隆抗體,單克

3、隆抗體,基因工程抗體,整體水平抗體生成技術,細胞工程抗體生成技術,基因工程抗體生成技術,,,多克隆抗體（抗血清）,單克隆抗體,嵌合抗體、改形抗體,“小型化抗體”（單鏈抗體）,組合抗體庫技術,噬菌體抗體庫技術,Ig基因轉基因小鼠,抗體真核表達技術,三、抗體分子的結構與功能,1、酶解片段,(1)Fab段　2個　抗原結合片段 　　 fragment with antigen binding (2)Fc段　 1個　可結

4、晶片段 　　 fragment crystallized,（1）Porter　 木瓜蛋白酶,(1)F(ab’)2 段 1個 結合顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應 (2)Fc’段　 1個 無生物學活性,（2）Nisonoff 胃蛋白酶,（1）、輕鏈（light chain，L鏈）　　　　214個氨基酸殘基，24

5、KD。　　　　分為：κ與λ　2個亞型。,（2）、重鏈（heavy chain，H鏈）　　450-550個氨基酸殘基，55-75KD。分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈?！　　　gM，IgG，IgA，IgD，IgE。,2、重鏈和輕鏈,3、可變區(qū)和恒定區(qū),（1）可變區(qū)（Variable region，V區(qū)）　　L鏈N端 1/2處（VL）110個aa;　　H鏈N端1/5-1/4處（VH）118個aa。,互補決定區(qū)（complemen

6、tarity-determining 　　　　　　region, CDR），HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3,（2）恒定區(qū)（constant region，C區(qū)）　　L鏈C端1/2處，105個aa; H鏈C端3/4-4/5處，331-431個aa。,在同一種屬動物中是比較恒定的,是制備第二抗體進行標記的重要基礎。,4、功能區(qū),鏈內二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為功能區(qū)，約由110個aa組成。,（1）L

7、鏈：2個，VL，CL各1,（2）H鏈：　　IgG，IgA，IgD：4個（V區(qū)1個，C區(qū)3個） 　　IgM，IgE：5個（V區(qū)1個，C區(qū)4個）,（3）功能區(qū)的作用：,（a）VL和VH：結合抗原決定簇（FV區(qū)）,（b）CL和CH：具有同種異型的遺傳標記,（c）CH2：結合補體,（d）CH3：結合Fc受體　　單核細胞，巨噬細胞，粒細胞，B細胞，　　NK細胞,C+V2Fab+FcF(ab’)2+ Fc’,V= FR+ HVR=FR+

8、CDRC=CL+CH1+CH2+CH3,Ab=,,,,,,CDR1,CDR2,CDR3,第二節(jié) 單克隆抗體,McAb是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產生的，故稱為單克隆抗體。,一、單克隆抗體制備過程,,,,,,,,,,,,,,,,,,注射抗原,,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,細胞融合、篩選,雜

9、交瘤細胞,細胞培養(yǎng),篩選，繼續(xù)培養(yǎng),足夠數(shù)量的、能產生特定抗體的細胞群,體外培養(yǎng),（注射到小鼠腹腔）,體內培養(yǎng),單克隆抗體,傳統(tǒng)抗血清,抗 原,免 疫,,,所有抗體混合,1,2,3,4,,,,脾 臟,淋巴結,B 細胞,多克隆抗體制備過程,1,2,3,4,1,2,3,4,單抗,細胞融合,取出脾細胞,,,+癌細胞,各抗體分開,單克隆抗體制備過程,1、抗原與動物免疫,抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動物：BALB/c小鼠或Lou大鼠免

10、疫方法：體內免疫和體外免疫,2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng),基本方法：取適量脾細胞（1*108）與骨髓瘤細胞（2*107~3*107）進行混合，在PEG作用下誘導它們融合，時間控制在2min以內，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋,用于細胞融和的骨髓瘤細胞應具備融和率高，自身不分泌抗體，所產生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。 PEG的相對分子質量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。

11、常用濃度為40%~50%，相對分子質量4000為佳。相對分子質量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內的PEG都能使細胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。,（1）細胞融合液中的細胞類型：4或5種。（2）如何去除脾-瘤以外的融和細胞？,HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷

12、DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA,,HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻 雜交瘤細胞：長期生長繁殖；利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA,3、篩選陽性克隆與克隆化,常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。,

13、有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培養(yǎng)液。,軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。,4、單抗檢測,RIA（放射免疫測定）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）FACS（流式細胞儀）IFA（間接免疫熒光法）,配制方案：雜交瘤細

14、胞（（1～5）x106/ml) + 細胞凍存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO )“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇,5、雜交瘤細胞的凍存與復蘇,細胞冷凍的意義：,防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡,經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍

15、存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。,6、單克隆抗體的大量制備,可獲得10µg/ml的抗體。多采用RPMI 1640培養(yǎng)液，添加10%~20%胎牛或小牛血清。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達100µg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質量差異太大，直接影響雜交瘤細胞的生長

16、。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細胞密度可2*107/ml, 收集的單克隆抗體可達400 µg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細胞密度可達108。,（1）體外培養(yǎng)法：,基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1

17、*106雜交瘤細胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點：操作簡便，比較經濟，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株。缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。,（2）動物體內誘生法,可獲得10µm/ml的抗體。常用方法。,腹腔注射法,7、單克隆抗體的純化,根據Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法：,體外診斷試劑Ig

18、G類-----沉淀處理+親和層析,IgM類------沉淀處理+凝膠過濾,體內診斷試劑或治療用藥-----親和層析+陰離子交換層析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。,鹽析沉淀親和層析離子交換層析,McAb的純化,8、 單克隆抗體的性質鑒定,Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示 表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競 爭抑制

19、法，相加指數(shù)法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用western blot,單克隆抗體的特性,高度特異性高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現(xiàn)沉淀反應對環(huán)境敏感性,A、McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內可產生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應，在人體內的半衰期只有5~6h，維持有效藥

20、物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。,McAb 在免疫導向療法中存在的問題（障礙）：,A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質量,需要解決的問題：,解決問題的方法或途徑—基因工程技術,1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質量只有完整抗體分子的1/8

21、0~1/3。,優(yōu)點 ：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療,單克隆抗體的優(yōu)點與局限性,局限性 ：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體制備技術復雜、費時費工、價格較高,第三節(jié) 基因工程抗體,基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 指用

22、基因工程方法，對抗體的基因進行重組、缺失、修飾改型等，構建載體，在受體細胞中表達，獲得抗體。,將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人Ab，再經雜交瘤技術，產生大量完全人源化抗體,一、人源化抗體,鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理,目的：一是降低免疫源性； 二是降低相對分子量，增加組織通透性,原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。在基因水平上把鼠源性單

23、克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達出完整的嵌合抗體.,人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。方法： 將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。 特點：

24、減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結合抗原的能力,（一）嵌合抗體,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,（二）改型抗體,經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變,結合半抗原及全抗原(如細胞表

25、面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。,定點突

26、變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。 研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。,Fab：抗原結合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段單域抗體最小識別單位,二、小分子抗體,分子量較小但具有抗

27、原結合功能的分子片段?；蚬こ绦》肿涌贵w僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質量僅為原抗體1/80~1/3。,,,,,,,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,,,,Fab,,,,,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。,(1)Fab,,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,,Fv,

28、,,ScFv,連接肽,,Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。單鏈抗體的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構

29、域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小識別單位,,CDR,,,可以用細菌發(fā)酵生產，成本低;分子小，穿透力強;不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應;在體內循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。,小分子抗體的優(yōu)點及應用,應用：

30、用于腫瘤的導向治療腫瘤的影像分布基因治療,優(yōu)點：,三、雙特異性抗體和多價抗體,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。 即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模

31、擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結合,激活效應細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質粒中,構建成雙鏈抗體的表達質粒,目前報道的表達質粒均為雙順反子。表達后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結,形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比

32、,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。,分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。,化學交聯(lián)BsAb,將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤 (quadroma)。

33、但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應 (HAMA)，因此不適用于臨床。,細胞工程BsAb,多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。,（1）配基—配基型融合蛋白，

34、如 CD4-Fcγ.（2）配基—Ig型嵌合抗體，如 IL-2-Ig（3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）,四、抗體融合蛋白,第四節(jié) 噬菌體抗體工程,它是在PCR技術和Phage Display的基礎上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀

35、噬菌體，抗體分子通過與P Ⅲ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。,噬菌體抗體庫技術,1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface dis

36、play system ),用PCR擴增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段?？贵w庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合 人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人,（一）基本原理和程序,,,,噬菌體抗體庫,（二）噬菌體表面展示文

37、庫技術的要點,外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導系列的緊靠下游,隨機克隆入相應載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段,,,,用固相化抗原經“親和結合一洗脫一擴增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經過純化即可獲得目的抗體。,,篩選到

38、的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，,,,（三）噬菌體抗體庫技術的特點,1、模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達到或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。,2、避開了人工免疫和雜交瘤技術

39、 由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術。,3、可獲得高親和力的人源化抗體 在噬菌體抗體庫技術中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。,將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術;抗體基因篩選的范圍廣;技術穩(wěn)定

40、、可靠、生產周期短;可規(guī)?；a;適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產。,該項技術的優(yōu)點:,噬菌體抗體庫技術的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。,原核細胞表達：真核細胞表達：酵母、昆蟲細胞、中國倉鼠卵細胞、真菌等。轉基因植物表達：煙草葉和擬南芥植物

41、。其產量可達葉片總蛋白量的1.3%。轉基因動物表達：單基因水平上做轉基因鼠。,基因工程抗體的表達,第五節(jié) 轉基因動物表達抗體,獲取人Ig基因：構建人Ig的YAC文庫及篩選,小鼠胚胎干細胞培養(yǎng),小鼠內源性Ig基因的敲除,獲得完整人Ig-YACs克隆,Ig-YACs克隆小ES細胞的導入,含人Ig-YACs的ES細胞移入小鼠胚胎,含人Ig-YACs的ES細胞的小鼠胚胎向小鼠體內送還嵌合,純合小鼠的產生和鑒定,純合小鼠制備特異性完全人源化抗體

42、,第六節(jié) 抗體診斷試劑和抗體藥物,抗原抗體特異性結合，在體內和體外均可呈現(xiàn)某種反應。在體內，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學診斷和血型測定，稱為血清學鑒定?？贵w診斷藥物基本分為三類：血清學鑒定用的和免疫標記技術用的抗體制劑，以及體內導向診斷藥物。,一、抗體診斷試劑,1、血清學鑒定用的抗體類試劑,（1）鑒

43、定病原菌用的抗體試劑,直接凝集反應,（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑,（3）妊娠診斷試劑,婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。,（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清,2、免疫標記技術用的抗體類試劑,給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可

44、對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機制提供手段。,（1）熒光抗體診斷試劑,熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。,酶標診斷試劑a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診斷試劑b、HBeAg(乙型肝炎

45、e抗原)酶標診斷試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑,（2）免疫酶抗體診斷試劑：,把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質。,（3）放射免疫用抗體診斷試劑,常用的標記抗體試劑：a、 HBsAg放射性核素標記抗

46、體診斷試劑：125I 標記，靈敏度0.1 ng/mlb、HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑： 125I 標記，靈敏度0.1 ng/mlc、HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑： 125I 標記d、 AFP放射性核素標記抗體診斷試劑： 125I 標記，靈敏度1~5 ng/mle、 CEA放射性核素標記抗體診斷試劑： 125I 標記，靈敏度1 ng/ml,3、導向診斷藥物 由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導

47、向藥物還未愛臨床廣泛應用。,二、抗體治療藥物,以抗體為載體的導向治療藥物的研究已有20多年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤相關的抗原，受試病人超過數(shù)千例。但治療用的制劑尚沒有一種達到商品化的程度。在治療藥物中，單克隆抗體與毒素的偶聯(lián)物治療淋巴瘤效果最佳，但有效率僅30%,目前的客觀現(xiàn)實是：研究進展迅速，但未達到常規(guī)治療的應用階段。障礙（原因）：抗體相對分子質量大，穿透力低，不能達到靶部位或攝取量低。鼠源性抗體的排斥

48、反應。,常用的抗癌藥物：氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM) 絲裂霉素(mitomycin,MMC）、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX) 、新抑癌蛋白(neocarzinostatin, NCS) 、正定霉素(doxorubicin, DOX)等。,小結,雜交瘤單克隆抗體制備技術的原理是利用聚乙二醇作為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細 胞與具有在體外不

49、斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一 體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經過反復的免疫學檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤 細胞系，將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。,20世紀80年代誕生了應用DNA重組及蛋白工程技術對編碼抗體基因按不同需要進行改造和裝配，經導入適當?shù)氖荏w細胞后重新表達的抗體，

50、稱為基因工程抗體，它具有如下優(yōu)點：①通過基因工程技術的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應；②基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；③根據治療的需要，制備新型抗體；④可以采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達形式，大量表達抗體分子，大大降低了生產成本。,雜交瘤技術是如何問世的？其基本原理是什么？什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？雜交瘤細胞的克隆方法