熊果酸對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NADPH氧化酶的活化及PI3K-Akt、P38MAPK信號通路的影響.pdf

1、背景:
　　肝纖維化是各種病因(如肝炎、血吸蟲、酒精和高脂等)所致的慢性肝損傷,主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟過度沉積。所有慢性肝病在向肝硬化方向發(fā)展過程中均不可避免地要經(jīng)歷肝纖維化階段。雖然此階段可逆,但目前臨床尚無有效的干預(yù)措施。
　　肝星狀細(xì)胞(HSC)是導(dǎo)致肝纖維化的主要細(xì)胞,HSC的激活、轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的重要事件。有許多促纖維化因子,如血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和瘦素等參與HSC

2、的激活與增殖。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)被認(rèn)為是重要的促纖維化因子之一,它通過促進(jìn) HSC活化、增殖,參與肝纖維化的發(fā)生。近年有研究顯示,NADPH氧化酶(NOX)介導(dǎo)了AngⅡ、TGF-β、瘦素等各種促纖維化因子在肝星狀細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),有可能成為治療肝纖維化的新靶點。
　　我們前期的研究以瘦素為促纖維化的因子,發(fā)現(xiàn)在HSC中,中藥單體熊果酸可以阻斷瘦素誘導(dǎo)HSC的NOX亞基表達(dá),從而抑制NOX的活性,達(dá)到阻斷瘦素引起的 HSC內(nèi)

3、的促肝纖維化信號通路激活,抑制 HSC增殖,促進(jìn)其凋亡。但熊果酸是否能阻斷AngⅡ、TGF-β等其它促纖維化因子引起的HSC內(nèi)信號通路激活,目前尚不清楚。本課題以活化型肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為研究對象,以AngⅡ為促纖維化因子,探討熊果酸是否也能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NOX激活,并阻斷其調(diào)控的PI3K/Akt、P38MAPK信號通路,從而抑制Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)及HSC-T6增殖,為將來熊果酸被臨床用來治療肝纖維化提供實驗資料和理論基礎(chǔ)

4、。
　　目的:
　　闡明熊果酸對AngⅡ引起HSC的NOX激活及其下游的PI3K/Akt、P38MAPK信號通路的影響。
　　方法:
　　1.在HSC-T6細(xì)胞中通過Western blotting檢測熊果酸對AngⅡ誘導(dǎo)的NOX亞基p47Phox膜移位的影響。
　　2.在HSC-T6細(xì)胞中通過Western blotting檢測熊果酸對AngⅡ誘導(dǎo)的PI3K/Akt、P38MAPK信號通路的影響
　

5、　3.在HSC-T6細(xì)胞中采用RT-PCR法檢測熊果酸對AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原表達(dá),采用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)果:
　　1.熊果酸對AngⅡ誘導(dǎo)的NOX亞基p47phox蛋白的膜移位的影響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用AngⅡ處理15min后,細(xì)胞膜上p47phox蛋白的表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);分別給予熊果酸及DPI進(jìn)行干預(yù)后細(xì)胞膜上p47phox蛋白的表達(dá)較單純AngⅡ組明顯降低(均P<

6、0.05),上述結(jié)果表明熊果酸能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NOX亞基p47phox向細(xì)胞膜移動,抑制NOX激活。
　　2.熊果酸對 AngⅡ誘導(dǎo)的 HSC-T6細(xì)胞內(nèi)的兩條信號通路 PI3K/Akt和P38MAPK活化的影響
　　2.1.熊果酸對AngⅡ處理后HSC-T6細(xì)胞內(nèi)PI3K蛋白的表達(dá)的影響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用 AngⅡ處理30min,PI3K的蛋白表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);而分別給予熊果酸、L

7、Y294002、DPI進(jìn)行干預(yù)后PI3K蛋白的表達(dá)較單純AngⅡ組均降低(均P<0.05)。結(jié)果表明熊果酸能下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的PI3K蛋白的表達(dá)。
　　2.2熊果酸對AngⅡ處理后 p-Akt蛋白的表達(dá)的影響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用AngⅡ處理30min后,p-Akt蛋白的表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);分別給予熊果酸、LY294002及DPI進(jìn)行干預(yù)后p-Akt蛋白的表達(dá)較單純AngⅡ組降低(均P<0.05)。

8、結(jié)果表明熊果酸能下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的p-Akt蛋白的表達(dá)。
　　2.3熊果酸對AngⅡ處理后p-P38MAPK蛋白表達(dá)的影響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用AngⅡ處理30min后,p-P38MAPK蛋白表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);分別給予熊果酸、SB203580、DPI進(jìn)行干預(yù)后p-P38MAPK蛋白的表達(dá)較單純AngⅡ組明顯降低(均P<0.05)。結(jié)果表明熊果酸能下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的p-P38MAPK蛋白的表達(dá)。

9、r>　　3.熊果酸對AngⅡ處理后Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)的影響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用AngⅡ處理12h后Ⅰ型膠原的mRNA的表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);分別給予熊果酸、DPI、SB203580、LY294002干預(yù)后Ⅰ型膠原的 mRNA表達(dá)較單純 AngⅡ組均明顯降低(均P<0.05)。上述結(jié)果表明熊果酸能下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原的mRNA的表達(dá)。
　　4.熊果酸對AngⅡ處理后HSC-T6細(xì)胞的增殖的影

10、響
　　HSC-T6細(xì)胞中,用AngⅡ刺激12h,24h,48h后細(xì)胞增殖明顯升高;分別給予熊果酸、DPI、SB203580、LY294002干預(yù)后細(xì)胞增殖均低于單純 AngⅡ組(P<0.05),上述結(jié)果表明熊果酸可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC-T6的細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　1.AngⅡ能誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的NOX亞基p47phox向細(xì)胞膜移位,激活NOX,激活PI3K/Akt、P38MAPK信號通路,進(jìn)而促進(jìn)HS