熊果酸對大鼠肝星狀細胞NOX亞基p47phox及其調控的下游信號通路的影響.pdf

1、背景：肝纖維化是肝臟慢性損傷后的一種普遍現象，最終導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝臟中過度沉積。瘦素是一個重要的促肝纖維化因子，它與HSC上的Ob受體結合后，引起Janus激酶(Janus kinase，JAK)磷酸化及JAK-信號轉導及轉錄激活因子(signal transducers and activators oftranscription factor，STAT)的活化。JAK還通過激活還

2、原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX)產生活性氧簇(Reactive oxygen spicies，ROS)，以還原-氧化方式激活細胞內信號通路如細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB，又稱AKT)，使信號級聯(lián)放大，導致與纖維生成及炎癥有關的基因表達。我們前期體內研究發(fā)現熊果酸(Urs

3、olic acid，UA)能明顯改善肝纖維化大鼠的肝組織結構，效果優(yōu)于秋水仙堿，體外實驗發(fā)現UA能抑制HSC的增殖，并誘導其凋亡；UA干預后能顯著抑制瘦素誘導的NOX亞基p22Phox和Rac1 mRNA的表達及ROS的產生，并能抑制核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)激活，從而誘導HSC的凋亡。本研究將基于前期的研究結果，進一步觀察UA對瘦素誘導的HSC NOX亞基p47Phox及下游信號通路ERK1/2的激

4、活和Ⅰ型膠原表達的影響，探討UA抗肝纖維化的分子機制。
　　 目的：探索UA對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)NOX亞基p47Phox及其調控的下游信號通路ERK1/2激活的影響，以及對HSC增殖及分泌細胞外基質的影響，為UA應用于抗肝纖維化治療提供理論依據。
　　 方法：將處于對數生長期的HSC-T6細胞分為6組：正常對照組；瘦素組(100ng/ml)；熊果酸(50μM)干預組(瘦素+熊果酸)；AG490(50μM)干預

5、組(瘦素+AG490)；DPI(20μM)干預組(瘦素+DPI)；PD98059(30μM)干預組(瘦素+PD98059)。在藥物作用HSC-T6細胞30min后，提取膜蛋白和總蛋白，采用Western blotting分別檢測p47Phox和p-ERK1/2的表達；藥物作用12h后，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原的表達；藥物作用12h、24h及48h后，采用MTT法檢測HSC-T6細胞的增殖情況。
　　 結果：⑴

6、熊果酸干預對瘦素誘導的NOX亞基p47phox蛋白膜移位的影響。瘦素刺激HSC-T6細胞30min后，細胞膜p47phox蛋白的表達較正常對照組升高(P<0.01)；熊果酸干預后的細胞膜p47phpx蛋白的表達明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AG490干預組及DPI干預組細胞膜p47phox蛋白的表達均低于瘦素組(P<0.01)；PD98059干預組細胞膜p47phox蛋白的表達低于瘦素

7、組(P<0.05)；熊果酸干預組、AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組間相比，細胞膜p47phox蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。上述結果表明熊果酸能抑制瘦素誘導的p47phox向細胞膜移位。⑵熊果酸對瘦素誘導的HSC-T6細胞ERK1/2蛋白磷酸化的影響。瘦素刺激HSC-T6細胞30min后，細胞內p-ERK1/2的表達較正常對照組升高(分別為P<0.01，P<0.05)；熊果酸干預后p-ERK1/2的表

8、達明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組p-ERK1/2的表達均低于瘦素組(分別為P<0.01，P<0.05)；熊果酸干預組、AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組間相比，p-ERK1/2表達的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。上述結果表明熊果酸可以降低瘦素介導的ERK1/2的磷酸化。⑶熊果酸對瘦素誘導的HSC-T6細胞Ⅰ型膠

9、原mRNA表達的影響。瘦素刺激HSC-T6細胞12h后Ⅰ型膠原的mRNA表達較正常對照組升高(P<0.01)；熊果酸干預后Ⅰ型膠原的mRNA表達明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組Ⅰ型膠原的mRNA表達均低于瘦素組(P<0.01)；熊果酸干預組、AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組間相比，Ⅰ型膠原的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意

10、義(均P>0.05)。上述結果表明熊果酸能下調瘦素介導的HSC-T6細胞Ⅰ型膠原mRNA的表達。⑷熊果酸對瘦素誘導的HSC-T6細胞增殖的影響。瘦素刺激HSC-T6細胞12h后細胞增殖高于正常對照組；熊果酸干預12h后細胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于DPI干預組的表達(P<0.01)，與AG490干預組、PD98059組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。瘦素刺激HSC-T6細胞24h后細胞增魑高于正常對照組；熊果酸干預24

11、h后細胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于AG490干預組、DPI干預組及PD98059干預組(P<0.01)；AG490干預組細胞增殖低于DPI干預組及PD98059干預組(P<0.01)；DPI干預組及PD98059干預組細胞增殖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。瘦素刺激HSC-T6細胞48h后細胞增殖高于正常對照組；熊果酸干預組48h后細胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于DPI干預組(P<0.01)，與AG490干預組及PD

12、98059干預組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DPI干預組48h后細胞增殖均低于熊果酸干預組、AG490干預組及PD98059干預組(P<0.01)；AG490干預組與PD98059干預組細胞增殖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果表明瘦素可促進HSC-T6細胞的增殖，而熊果酸可以抑制其增殖。
　　 結論：①瘦素能誘導HSC-T6細胞的NOX亞基p47phox蛋白向細胞膜移位，使NOX激活，同時誘導了ERK1/2的磷酸化：熊果