rhHSP70聯(lián)合HBxAg負(fù)載樹突狀細(xì)胞治療HBV相關(guān)肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是體內(nèi)已知功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),在體內(nèi)外唯一能直接激活初始型T細(xì)胞(naive T cell),進(jìn)行加工、處理和遞呈到組織相容性抗原(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子上,并激活細(xì)胞毒T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL),在抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要的作用。而腫瘤患者體內(nèi)DCs存在數(shù)量和功能上的缺陷,無法誘導(dǎo)初次免

2、疫應(yīng)答和激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)效應(yīng),使機(jī)體無法對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生再次免疫應(yīng)答。
　　原發(fā)性肝癌(因主要是肝細(xì)胞肝癌,故稱為hepatocellular carcinoma,HCC,簡(jiǎn)稱“肝癌”)一種高度惡性的腫瘤,我國是肝癌高發(fā)的國家,每年的發(fā)生率占全世界的54％。肝癌的評(píng)價(jià)生存期一般不超過6個(gè)月,對(duì)放、化療均不敏感,故現(xiàn)行治療肝癌的方法主要還是以手術(shù)等局部治療為主的綜合治療,盡管如此,目前我國肝癌患者總體的五年生存率

3、僅在10％左右,中晚期肝癌的五年生存率更低。近年來,腫瘤的免疫治療成為腫瘤研究的新熱點(diǎn),其中以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗(簡(jiǎn)稱DC瘤苗)在實(shí)驗(yàn)性肝癌免疫治療中取得了良好效果。目前,國內(nèi)外學(xué)者大多采用腫瘤細(xì)胞凍融裂解物、AFP多肽等負(fù)載DCs治療肝癌,也都取得了一定的療效,但因負(fù)載物單一、免疫原性低,其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較低,療效也有限,因此,探索新的負(fù)載物,構(gòu)建新的高效DC瘤苗對(duì)肝癌的臨床治療有著重要的意義。
　　HBV感染與HCC的發(fā)生

4、密切相關(guān),進(jìn)一步的研究表明HBV X基因的編碼蛋白HBx蛋白(HBxAg)在HCC的發(fā)生過程中起著重要的作用。HBxAg在肝癌組織中的陽性表達(dá)率達(dá)70％-80％,因此HBxAg可作為理想的抗原識(shí)別靶點(diǎn),將HBxAg作為抗原負(fù)載DC,制備DC疫苗將可能成為肝癌生物免疫治療的一個(gè)新的思路。熱休克蛋白70(HSP70)家族是一類重要的應(yīng)激蛋白,在腫瘤勉一中發(fā)揮免疫佐劑的功能,通過分子載體的作用將抗原肽呈遞至APC表面,激活CD8+T細(xì)胞,達(dá)到

5、殺傷腫瘤細(xì)胞的目的,HSP70對(duì)開發(fā)腫瘤疫苗也有重要的意義。本研究采用以HBV病毒抗原多肽HBxAg作為靶抗原,利用rhHSP70結(jié)合多肽的生物學(xué)活性,體外制備rhHSP70-HBxAg復(fù)合物增強(qiáng)多肽的穩(wěn)定性與抗原性,采用人體專職性抗原遞呈細(xì)胞DCs作為rhHSP70-HBxAg復(fù)合物的承載體,增加疫苗的免疫原性,制備rhHSP70-HBxAg-DC活細(xì)胞瘤苗,并進(jìn)一步研究該瘤苗對(duì)HBxAg表達(dá)陽性的肝癌細(xì)胞的殺傷效能。
　　第一

6、部分構(gòu)建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗,并鑒定其生物學(xué)功能
　　目的:構(gòu)建rhHSP70-HbxAg-DC瘤苗,并鑒定其生物學(xué)功能。
　　方法:(1)采集HLA-A2+健康獻(xiàn)血員外周血,經(jīng)Ficoll分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),其中貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生DCs,每日觀察DCs形態(tài)變化;(2)DCs生長(zhǎng)第7日開始負(fù)載不同濃度的rhHSP70

7、、HBxAg及rhHSP70-HBxAg復(fù)合物,流式細(xì)胞檢測(cè)CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的分泌,尋找出最適抗原負(fù)載濃度;(3)未貼壁細(xì)胞經(jīng)尼龍毛柱分離獲得T淋巴細(xì)胞,以最適抗原濃度體外構(gòu)建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗,并將T淋巴細(xì)胞與rhHSP70-HBxAg-DC共培養(yǎng)誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞及特異性CTL細(xì)胞,CCK-8試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　結(jié)果

8、:(1)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),DCs出現(xiàn)拉長(zhǎng),呈細(xì)樹枝狀典型形態(tài);(2)不同濃度的rhHSP70及HBxAg負(fù)載DCs后流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表型的表達(dá)及ELISA檢測(cè) IL-12的分泌顯示兩種抗原的最適濃度分別為rhHSP70:20μg/ml, HbxAg:5μg/ml;(3)負(fù)載抗原的DCs,高表達(dá)CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR,細(xì)胞因子IL-12的分泌也顯著增加,其中rhHSP70-HBxAg組最高;(4) rh

9、HSP70-HBxAg-DC瘤苗可明顯刺激T淋巴細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:外周血來源的DCs負(fù)載rhHSP70和(或)HBxAg后,可分化為成熟DCs,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。
　　第二部分 rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效能研究
　　目的:研究rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效能。
　　方法:(1)rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CTL細(xì)胞,體外殺傷靶

10、細(xì)胞,LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)CTL細(xì)胞對(duì)不同處理組靶細(xì)胞的殺傷效能;(2)用轉(zhuǎn)染了HBx基因的HepG2(HBx-HepG2)建立小鼠皮下移植瘤模型,將30只小鼠隨機(jī)分為rhHSP70-HBxAg-DC組、未負(fù)載抗原的DC組、PBS組,每3日測(cè)量瘤體體積,比較各組對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用;(3)治療后第28d處死小鼠,分離瘤體,行免疫組化檢測(cè)瘤體HBx蛋白、AFP以及Bcl-2、PCNA、Fas、Bax、Caspase的表達(dá)。
　　

11、結(jié)果:(1)rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞能有效殺傷HBx-HepG2細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞,其中對(duì)HBx-HepG2細(xì)胞的殺傷最明顯,而對(duì)NK細(xì)胞敏感的K562細(xì)胞及正常肝細(xì)胞L02無明顯殺傷作用,同時(shí)對(duì)被抗MHC-Ⅰ類復(fù)合物抗體處理過的HBx-HepG2細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞殺傷效能明顯下降;(2) rhHSP70-HBxAg-DC組和對(duì)照組的移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制,其中rhHSP70-HBxAg-