rhHSP70聯(lián)合凍融抗原修飾樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的抗肝癌作用.pdf

1、目的： 樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，能高效能遞呈抗原，且是唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，具有獨(dú)特的誘導(dǎo)初始免疫反應(yīng)對(duì)抗腫瘤的能力。目前在DCs疫苗抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究方面已取得了令人振奮的進(jìn)展，顯示了廣泛的應(yīng)用前景。但腫瘤疫苗研制中仍然存在著一個(gè)主要問題：大多數(shù)腫瘤抗原的免疫原性很弱，不能正常

2、的被呈遞以激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxict lymphocytes，CTLs)，為了提高其免疫原性，必須加入佐劑。研究已表明HSP70具有佐劑樣作用，HSP70可以促進(jìn)DCs成熟，刺激多種細(xì)胞因子的分泌而增強(qiáng)免疫功能。本研究對(duì)DCs被重組人熱休克蛋白70(recombinant human heat shock protein70，rhHSP70)和肝癌凍融抗原共同修飾前后的表型變化、形態(tài)變化及誘導(dǎo)CTLs產(chǎn)生的體外殺傷肝癌

3、細(xì)胞作用進(jìn)行了觀察，以其明確rhHSP70聯(lián)合肝癌凍融抗原共同修飾DCs后，體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)肝癌細(xì)胞的高效殺傷作用，并初步探討了rhHSP70增強(qiáng)DCs疫苗抗腫瘤能力的機(jī)制，為設(shè)計(jì)以DCs為基礎(chǔ)的針對(duì)肝癌的生物治療的高效瘤苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法： 分離健康人外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)粒—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte—macrophage colony—stimulating factor，GM—

4、CSF)，白細(xì)胞介素4(interleukin—4，IL—4)誘導(dǎo)生成DCs，負(fù)載凍融抗原的同時(shí)加入rhHSP70，分為四組：①A組：DCs+凍融抗原(Ag)；②B組：DCs+rhHSP70；③C組：DCs+Ag+rhHSP70；④D組：單獨(dú)DCs。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測各組DCs表型(CD80，CD83，CD86)變化，倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察各組DCs形態(tài)特點(diǎn)。不同分組修飾的DCs激活淋巴細(xì)胞生成CT

5、Ls，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力以及CTLs對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷活性，熒光染色觀察各組肝癌細(xì)胞凋亡差異。 結(jié)果： rhHSP70，凍融抗原及二者聯(lián)合修飾的DCs表型較對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。CD80：A組為80.2±2.5％，B組為79.6±2.6％，C組為81.6±2.3％，D組為21.5±1.4％。CD83：A組為71.3±2.9％，B組為68.3±2.4％，C組為73.4±

6、2.1％，D組為33.4±2.4％。CD86：A組為74.2±3.6％，B組為75.3±4.8％，C組為82.5±5.0％，D組為48.2±2.8％。 光鏡及掃描電鏡下可見rhHSP70，凍融抗原及二者聯(lián)合修飾的DCs較對(duì)照組樹枝狀突起明顯增加，表現(xiàn)出成熟DCs的形態(tài)特征，而對(duì)照組表現(xiàn)出相對(duì)不成熟DCs的形態(tài)特征。 不同分組修飾的DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖能力不同，結(jié)果以增殖指數(shù)(proliferation index，PI

7、，增殖指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)表示。其中A組為2.10±0.05，B組為2.06±0.05，C組為2.60±0.06，D組為1.20±0.05，PI以C組為最高，與其他兩試驗(yàn)組(A，B組)相比差異顯著(P<0.05)，其次為A組，但A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 不同分組DCs呈遞腫瘤抗原誘導(dǎo)的CTL產(chǎn)生殺傷率不同，殺傷百分率=(1—實(shí)驗(yàn)組的OD值/對(duì)照組的OD值)×100％。在效靶比(效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)

8、胞，即CTLs：肝癌細(xì)胞)為10：1，20：1，50：1時(shí)，A組殺傷率分別為40.27±4.89％，47.13±8.05％，51.64±6.73％，B組殺傷率分別為13.58±4.77％，12.13±4.26％，15.57±5.55％，C組殺傷率分別為61.09±7.89％，64.71±3.90％，74.59±3.34％，D組殺傷率分別為11.94±4.11％，13.90±4.11％，13.52±4.61％，在三種效靶比下殺傷率以C組為