HBV特異性細胞免疫與樹突狀細胞蛋白酶體功能相關性實驗研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染的過程中，HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是清除病毒的關鍵因素，而樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)作為專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells，APCs)，對CTL的誘導又起著決定性的作用；正常功能的DC對乙型肝炎患者的病情進展、血清轉化乃至預后都有著重要影響。但是，在乙型肝炎尤其是慢乙肝患者，DCs數量和功能均呈下降趨勢。DCs為何會發(fā)生數量減少和功能降低

2、至今仍未完全闡明。近年來有相關文獻報道了慢性病毒感染會減弱所在細胞的蛋白酶體功能，如HIV、HSV等(1，2)。受此啟發(fā)，我們的實驗對乙肝慢性化過程中HBV復制與DCs的蛋白酶體功能做了一系列的臨床和基礎研究，以期為打破慢乙肝患者體內免疫耐受、誘導有效細胞免疫提供新的思路。全文共分三章：
　　 第一章.慢乙肝患者DCs蛋白酶體功能分析
　　 1.目的
　　 優(yōu)化人單核細胞源性樹突狀細胞(MoDCs)分離誘導方法，

3、探討慢乙肝患者體內樹突狀細胞蛋白酶體功能變化情況。
　　 2.材料和方法
　　 應用連續(xù)貼壁法及磁珠法分離培養(yǎng)人單核細胞源性樹突狀細胞(MoDC s)，誘導成熟后經流式細胞儀檢測細胞表面標志(CD80，CD86，HLA-DR)，比較兩種方法及不同誘導因素對DCs分化的影響。
　　 分離誘導慢乙肝患者的MoDCs，分析其蛋白酶體相關亞基表達及蛋白降解活性。
　　 3.結果
　　 流式細胞儀檢測結果顯

4、示，兩種分離方式誘導的MoDCs表面HLA-DR、CD83、CD86表達水平相差甚微；但磁珠分離法所得MoDCs純度較高。以TNF-α和HBcAg分別誘導樹突狀細胞成熟，誘導后MoDCs的HLA-DR、CD83、CD86水平明顯高于未加誘導劑組，但TNF-α和HBcAg誘導的組間差距不大。
　　 實驗結果顯示，相對于正常對照組，慢乙肝患者的MoDC免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7表達率明顯下降，且蛋白酶體功能出現下調；而蛋白酶

5、體功能下降程度與患者ALT及HBV DNA水平無顯著相關性。
　　 4.結論
　　 采用磁珠分離法可獲得純度較高的MoDCs，來源廣泛，獲取簡單。所得DCs在體外培養(yǎng)的條件下可以穩(wěn)定存在1w左右。流式細胞儀鑒定結果顯示MoDCs表面特征分子表達明顯，細胞狀態(tài)較好，完全可以滿足下游實驗的需要。
　　 臨床試驗顯示慢乙肝患者體內DCs蛋白酶體功能下調，免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7合成受阻，提示DCs蛋白酶體功能

6、異常可能與慢乙肝患者免疫耐受發(fā)生有關。
　　 第二章.HBV復制導致DC蛋白酶體功能下調的機制研究
　　 1.目的
　　 構建HBV全基因真核表達質粒pCDNA-HBV-EGFP，采用脂質體和電轉染將質粒轉入MoDCs并得以表達。觀察HBV基因復制及相關蛋白合成對MoDCs蛋白酶體功能的影響。
　　 2.材料與方法
　　 擴增HBV全基因并將其克隆至帶有報告基因EGFP的pCDNA3.1質粒中，構

7、建能夠表達HBV全基因的真核表達質粒pCDNA-HBV-EGFP，酶切鑒定。
　　 以磁珠法分離誘導MoDCs，誘導成熟后分別以脂質體法和微量電轉法轉染pCDNA-HBV-EGFP入MoDCs，觀察HBV基因復制和病毒相關蛋白表達對MoDCs的蛋白酶體功能的影響。
　　 3.結果
　　 成功構建可以表達HBV全基因的真核表達質粒pCDNA-HBV-EGFP，雙酶切鑒定顯示質粒構建成功。運用脂質體及微量電轉法兩種方

8、式轉染改質粒入MoDCs，轉染后RT-PCR、western blot、綠色熒光蛋白以及免疫熒光結果顯示HBV在MoDCs內得到較高程度表達；而隨著HBV基因復制和相關蛋白成分表達，MoDCs的蛋白酶體活性呈現下調趨勢，表現為免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7表達下降，同時MoDCs刺激同種異體T細胞增殖及細胞因子分泌能力也較對照組降低。
　　 4.結論
　　 所構建pCDNA-HBV-EGFP真核表達質粒轉染入MoDC

9、s可有效表達HBV相關蛋白，而HBV復制可下調MoDCs的蛋白酶體亞基生成，并抑制蛋白酶體的正常功能。
　　 第三章.蛋白酶體功能抑制對乙肝病毒復制的影響
　　 1.目的
　　 以不同劑量的蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin干預HepG2.2.15，以MTT法檢測蛋白酶體抑制劑MG132和Epoxomicin對HepG2.2.15細胞的毒性。在此基礎上選取合適劑量觀察蛋白酶體抑制劑對HBV基因復制和蛋

10、白表達的影響，探討以蛋白酶體做為新的靶點抑制HBV復制的可行性。
　　 2.材料和方法
　　 優(yōu)化HepG2.2.15細胞培養(yǎng)及傳代條件，以不同劑量的蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin干預HepG2.2.15。得出IC50值，在此基礎上以RT-PCR、westernblot、免疫熒光技術判斷蛋白酶體抑制劑對HBV基因復制和蛋白表達的影響。
　　 3.結果
　　 MG132和Epoxomicin

11、作用的HepG2-2.215細胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg均有明顯下降，且對胞內HBcAg的生成也有一定的抑制作用；抑制程度隨著蛋白酶體抑制劑濃度的增加而呈遞增趨勢，表現出較好的劑量依賴性和抑制效率。
　　 4.結論
　　 蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin可有效抑制HepG2.2.215細胞中HBV的基因復制及病毒抗原的表達；此外，蛋白酶體抑制劑對于HBcAg介導的核衣殼包裝也有一定的抑制