蛋白酶激活受體在A549細(xì)胞的表達(dá)及其誘導(dǎo)趨化因子釋放的研究.pdf

1、哮喘是一種具有可逆性氣道阻塞、支氣管高反應(yīng)性、炎癥以及遺傳特異性的疾病,其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。眾所周知,變態(tài)反應(yīng)性疾病與過敏原的反復(fù)接觸有密切關(guān)系。雖然哮喘與變態(tài)反應(yīng)性疾病的確切關(guān)系還不十分明確。但作為首先接觸吸入性抗原的呼吸道上皮細(xì)胞,在哮喘與變態(tài)反應(yīng)性疾病中有重要作用,呼吸道上皮細(xì)胞能夠釋放許多與哮喘和變態(tài)反應(yīng)這兩種炎癥性疾病密切相關(guān)的介質(zhì)和細(xì)胞因子,如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8

2、、GM-CSF、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)、RANTES和嗜酸性細(xì)胞趨化因子(eotaxin)等。這些細(xì)胞因子通過募集、激活炎癥性細(xì)胞而參與炎癥過程。
　　絲氨酸蛋白酶在氣道疾病中的作用,特別是類胰蛋白酶、凝血酶和彈性蛋白酶在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用日益受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),不僅絲氨酸蛋白酶在哮喘過程中過度分泌,而且它們在氣道炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成和分泌中起著重要作用。但是,絲氨酸蛋白酶在呼吸道上皮中如何發(fā)揮作用,其機(jī)制

3、尚不清楚。有報導(dǎo)認(rèn)為,氣道中的趨化因子IL-8和MCP-1在哮喘中的分泌增加,因此,我們利用A549細(xì)胞—一種人腺癌II型肺泡上皮細(xì)胞系來研究類胰蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶和彈性蛋白酶對肺上皮細(xì)胞IL-8和MCP-1分泌和基因表達(dá)的影響。
　　蛋白酶激活受體(protease-activated receptors, PARs)已經(jīng)被證明是絲氨酸蛋白酶的受體。PARs屬G蛋白耦聯(lián)受體家族,是具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的受體。絲氨酸蛋白酶可以酶

4、切PARs的N末端,暴露含有系鎖配體的新的N末端,新的N末端作為系鎖配體可自我激活PARs。在目前發(fā)現(xiàn)的四種PARs中,PAR-1是凝血酶和胰蛋白酶的受體;PAR-2是類胰蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶的受體;PAR-3和PAR-4也是凝血酶的受體。PARs分布在多種組織細(xì)胞上,PARs的激活能夠引起不同的細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子。PARs的激活能引起人肥大細(xì)胞組胺的釋放;誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌 IL-6;成纖維細(xì)胞分泌IL-1;人口腔上皮細(xì)胞

5、分泌IL-8。本實驗研究四種PARs的激活對A549細(xì)胞IL-8和MCP-1釋放的影響。既然A549細(xì)胞上的PARs在絲氨酸蛋白酶的作用中起關(guān)鍵作用,因此,我們對A549細(xì)胞PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4的表達(dá)進(jìn)行研究。
　　方法:
　　(1) A549細(xì)胞PARs表達(dá)的鑒定:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)分析肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞PAR-1、PAR-2、P

6、AR-3和PAR-4的表達(dá)情況。
　　(2)上皮細(xì)胞的激發(fā)實驗:細(xì)胞換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12-16 h后,加入各種濃度的凝血酶(0.01–10 U/ml,1 U/ml=6.7 nM)、胰蛋白酶(1–300 ng/ml,1μg/ml=42 nM)、類胰蛋白酶(0.125–2μg/ml,1μg/ml=7.4 nM)、彈性蛋白酶(0.01–0.6μg/ml,1μg/ml=34 nM)和它們相應(yīng)的抑制劑;加入PARs-AP或它們的反激動肽(

7、0.1-100μM,PAR-1-AP濃度為0.1-300μM);分別刺激細(xì)胞2 h、8 h和16 h后,收集細(xì)胞上清液,離心后分裝,置-80℃冰箱中凍存。細(xì)胞上清液中 IL-8和MCP-1的濃度用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測。
　　(3)A549細(xì)胞IL-8和MCP-1的mRNA的表達(dá):用實時熒光定量PCR方法研究PARs激活后A549細(xì)胞IL-8和MCP-1的mRNA的表達(dá)情況。(4)PAR-2激活對A549肺上皮細(xì)胞[Ca2+]

8、i的影響:應(yīng)用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測PAR-2激活后A549細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i水平。
　　結(jié)果:
　　(1)利用 RT-PCR、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)檢測到了四種PARs在肺上皮細(xì)胞A549上的表達(dá)。
　　(2)上皮細(xì)胞激發(fā)實驗顯示,凝血酶、類胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰蛋白酶與A549細(xì)胞相互作用16 h后,分別誘導(dǎo)A549細(xì)胞IL-8的釋放增加8、4.3、4.4和5.

9、1倍;誘導(dǎo) A549細(xì)胞MCP-1的釋放分別增加6.5、1.8、1.6和3.1倍。凝血酶、彈性蛋白酶和胰蛋白酶所誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1釋放可以被其相應(yīng)的抑制劑所抑制。PAR-1、PAR-2和PAR-4的激動肽分別誘導(dǎo)細(xì)胞IL-8分泌增加15.6、6.6和3.5倍;PAR-1、PAR-2激動肽分別誘導(dǎo)細(xì)胞MCP-1的分泌增加15和12.7倍。
　　(3)實時熒光定量PCR研究顯示,絲氨酸蛋白酶及PAR-1和PAR-2激動肽可以上

10、調(diào)IL-8和MCP-1的mRNA的表達(dá)。
　　(4)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測顯示,胰蛋白酶、SLIGKV、tc-LIGRLO均能引發(fā)A549細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i增加,平均熒光強度分別比加入試劑前增加92％、47%和130%。大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)(一種常用的胰蛋白酶抑制劑)和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)可以抑制胰蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的增加。
　　結(jié)論:
　　絲氨酸蛋白酶可能通過PARs激活誘導(dǎo)A