5-溴脫氧尿嘧啶核苷對成人骨髓間充質(zhì)干細胞體外標記的研究.pdf

1、目的 建立成人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)和鑒定的方法，探討連續(xù)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記的穩(wěn)定性、最佳時間和劑量，爭取確定應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞進行研究最好的示蹤指標。 方法 采集成人骨髓10mL，密度梯度法分離出單個核細胞；貼壁篩選法培養(yǎng)純化和擴增MSCs；倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；取生長良好的P3細胞，流式細胞儀(FCM)檢測細胞的表面抗原(CD44、CD7

2、1、CD34、HLA-DR)；收集生長良好的P1、P3、P5成人骨髓MSCs，用1Oμmol/L濃度的BrdU標記至細胞生長融合，免疫細胞化學法檢測標記率(LI)；選擇P3細胞，以5、10、15/μmol/L濃度的BrdU分別標記12、24、48、72、96h；檢測不同時間不同濃度的標記率；將10μmol/LBrdU標記72h的P3細胞連續(xù)傳代，觀察傳代后的細胞形態(tài)及增殖情況。 結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的成人骨髓M

3、SCs形態(tài)均一，為梭形或紡錘形的成纖維細胞樣外觀； FCM檢測細胞表達CD44和CD71，不表達CD34和HLA-DR；大部分MSCs經(jīng)BrdU標記后核抗BrdU染色陽性，P1、P3、P5各代間不會隨著傳代次數(shù)的增加而降低標記率；隨著標記濃度的升高和標記時間的延長，標記率逐漸增高，濃度10μmol/L標記72h標記率在90％以上；標記細胞連續(xù)傳代，細胞形態(tài)無明顯變化。結(jié)論密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)和消化控制相結(jié)合的方法是體外分離培養(yǎng)人骨髓M