山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow me(?)enchymal stem cells，BMSCs)來源于中胚層，主要存在于全身的結(jié)締組織與器官間質(zhì)中，以骨髓中的含量最多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新的能力與多向分化、增殖的潛能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因?yàn)榫哂锌捎谧泽w獲得、易培養(yǎng)、移植后能夠長期存活并且不會出現(xiàn)排斥反應(yīng)，可被外源基因轉(zhuǎn)染并長期表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，近年來成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療及器官移植的研究熱點(diǎn)，

2、在多學(xué)科多領(lǐng)域做為一種理想的種子細(xì)胞得到了廣泛應(yīng)用。但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雖然在體內(nèi)的來源比較廣泛，但是數(shù)量極少，并且隨著身體機(jī)能的下降與個(gè)體的衰老，數(shù)量會逐漸減少。而組織工程與細(xì)胞工程開展的首要條件是種子細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)傳代，如何能夠在體外獲得足夠數(shù)量和較高純度的種子細(xì)胞極其重要。而且目前尚沒有對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行直接鑒定的方法。通過本研究擬建立一種體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想方法，并且觀察其生長特性，探討其鑒定方法，為其

3、在組織工程學(xué)與細(xì)胞工程學(xué)等學(xué)科的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。材料與方法
　　 選用健康中國青山羊，骨髓穿刺法抽取髂骨骨髓，應(yīng)用密度梯度離心法從中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)合貼壁篩選法進(jìn)行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況，測定細(xì)胞成活率及傳代細(xì)胞貼壁率，對第2、4、6代細(xì)胞采用連續(xù)計(jì)數(shù)法繪制出生長曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志。結(jié)果
　　 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)觀察：培養(yǎng)后24h可見部

4、分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞多呈橢圓形。48h后可見更多的細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞有伸展變形現(xiàn)象，細(xì)胞伸出偽足，形態(tài)漸變?yōu)樗笮巍⒍嘟切巍?～6d后可見數(shù)個(gè)細(xì)胞集落形成，顯微鏡下見貼壁細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞核清晰。隨培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞集落進(jìn)一步增多，細(xì)胞生長逐漸融成片狀，12～14d時(shí)可長滿培養(yǎng)瓶底80％。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)：細(xì)胞傳代后6～8d即可長滿瓶底，細(xì)胞融合率可達(dá)100％。傳代細(xì)胞鏡下呈均一長梭形，細(xì)胞膜及細(xì)胞核清晰，

5、細(xì)胞密度較高時(shí)呈放射狀、漩渦狀排列。
　　 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果：第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫組化染色，細(xì)胞表面抗原CD29，CD44呈陽性表達(dá)（胞漿呈黃褐色染色），CD34，CD45呈陰性表達(dá)。
　　 4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線與倍增時(shí)間：生長曲線呈S型，1～3d為潛伏期，生長速度較為緩慢；2～3d后進(jìn)入對數(shù)增長期，生長速度明顯加快；6～7d后進(jìn)入平臺期，生長速度趨于穩(wěn)定。第2、4、6代細(xì)胞平均倍增時(shí)間分別