地塞米松拮抗紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、近年來紫杉醇聯(lián)合順鉑的化療方案(PT方案)已廣泛應用于臨床治療卵巢癌,尤其是卵巢癌晚期無法手術的姑息治療、一線化療失敗或多次化療失敗的轉移性卵巢癌,為了防止化療時紫杉醇藥物發(fā)生嚴重的過敏及惡心嘔吐等反應,在接受化療前的所有患者應事先進行地塞米松預防用藥。但近來許多研究表明,地塞米松能選擇性抑制紫杉醇誘導一些腫瘤細胞的凋亡,下調機體的免疫反應,導致腫瘤組織轉移,影響紫杉醇在惡性腫瘤化療中的療效,那么地塞米松對紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡的作用

2、如何,是否拮抗紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡從而降低紫杉醇的療效?因此,本項目以人卵巢癌細胞株SKOV-3為材料,通過體外實驗探討地塞米松預處理對紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡產生的影響、發(fā)生的可能機制,并建立SKOV-3裸鼠移植瘤,通過體內實驗進一步探討地塞米松對紫杉醇抗腫瘤療效的影響,對今后在臨床工作中如何正確認識和使用地塞米松以及開發(fā)紫杉醇的給藥途徑必將產生深遠的影響。 第一部分 地塞米松對紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋

3、亡的保護作用 目的：探討地塞米松(Dex)對紫杉醇(PTX)抑制人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞增殖及誘導SKOV-3細胞凋亡的影響。 方法： (一)MTT法測定細胞增殖 1、用含不同濃度紫杉醇(10 nM、20 nM、50 nM、100 nM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3細胞24小時,測定紫杉醇對SKOV-3細胞增殖的影響。 2、用不同濃度地塞米松(0、0.001 uM、0.01 uM、0.1 uM、

4、1 uM)對SKOV-3細胞進行預處理24h后,每組中分別再用含不同濃度的紫杉醇(0、10 nM、20 nM、50 nM、100nM)培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24h,測定不同濃度的地塞米松對不同濃度的紫杉醇進行預處理后對SKOV-3細胞增殖的影響。 (二)TUNEL聯(lián)合DAB染色從形態(tài)學觀察地塞米松對紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡的影響。 (三)PI單染法測定地塞米松對紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡及細

5、胞周期的影響。 結果： (一)PTX能夠抑制人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞增殖,且與PTX的濃度有關,濃度越高,抑制率越大。 (二)0.001～1uM濃度范圍內地塞米松對紫杉醇抑制人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞增殖有不同程度的保護作用。 (三)TUNEL法聯(lián)合DAB染色進行形態(tài)學觀察,對照組中極少見到凋亡細胞,PTX組出現(xiàn)大量DAB染的胞核呈棕黃色的凋亡細胞,表現(xiàn)為核固縮,染色質邊聚,凝集成塊,并可見散在

6、棕色的凋亡小體。但預先用地塞米松進行處理后再用PTX處理組出現(xiàn)凋亡細胞較單用紫杉醇明顯減少。凋亡指數(shù)(AI)在對照組和Dex組分別為3.5±0.25％和4.0±0.26％兩組間無差異,在Dex+PTX組與PTX組為11.7±1.72％和30.8±1.15％,兩組與對照組比較差異顯著(P<0.01),且Dex+PTX組與PTX組比較,Dex+PTX組凋亡指數(shù)降低,有明顯差異(P<0.01)。 (四)PI單染檢測細胞凋亡率表明地塞米

7、松進行預處理后再用紫杉醇組細胞凋亡率為5.55±0.53％較單用紫杉醇組細胞凋亡率13.90±1.62％明顯降低(P<0.01),而且在地塞米松拮抗紫杉醇誘導SKOV-3細胞凋亡中,用地塞米松預處理后再用紫杉醇組與單用紫杉醇組比較,細胞周期中G2/M期無明顯差異(P>0.05)。 結論： (一)地塞米松對紫杉醇抑制人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞增殖有保護作用,且與地塞米松的給藥濃度有關。 (二)地塞米松能拮抗紫杉

8、醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡,但與細胞周期中G2/M期停滯無關。 第二部分 地塞米松拮抗紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡的可能機制 目的：從IAP家族中抗凋亡基因Survivin和Bcl-2家族中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL兩條通路,探討地塞米松拮抗紫杉醇誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞凋亡的可能機制,并為下一步的動物實驗奠定基礎。 方法：將細胞用不同藥物處理后,用半定量RT-P

9、CR檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bcl-XL and Survivin mRNA的表達。Western blot檢測BcI-XL和末端半胱氨酸蛋白酶Cleaved-caspase-3蛋白的表達。 結果： (一)用地塞米松進行預處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組BcI-XL mRNA、Survivin mRNA的表達明顯高于PTX組(P<0.01)。 (二)Bcl

10、-2蛋白家族成員Bcl-2 mRNA的表達:Dex組和Dex+PTX組Bcl-2蛋白家族成員Bcl-2 mRNA的表達較對照組無差異(P>0.05),Dex+PTX組與PTX組之間比較也無差異(P>0.05)。 (三)BcI-XL蛋白水平表達:Dex組較對照組升高(p<0.01),而且用地塞米松進行預處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組Bcl-XL蛋白表達明顯高于PTX組(P<0

11、.01)。 (四)Cleaved caspase-3蛋白水平表達:Dex組和Dex+PTX組較對照組明顯降低(p<0.01),而且用地塞米松進行預處理后再用紫杉醇組(Dex+PTX組)與單用紫杉醇組(PTX組)比較,Dex+PTX組Cleaved caspasc-3蛋白表達明顯低于PTX組(P<0.01)。 結論：地塞米松對紫杉醇的抗凋亡作用可能通過上調IAP家族中Survivin和Bcl-2家族中Bcl-XL抗凋亡基因

12、的表達,下調caspase3活性,從而抑制人卵巢細胞株SKOV-3細胞凋亡。 第三部分 地塞米松在人卵巢癌細胞株SKOV-3裸鼠移植瘤中對紫杉醇抗腫瘤療效的影響 目的：通過建立人卵巢癌細胞株SKOV-3裸鼠移植瘤模型進行體內實驗,評價地塞米松進行預處理后,對紫杉醇抗腫瘤作用的影響,并進一步分析其作用機理。 方法： (一)建立人卵巢癌細胞株SKOV-3裸鼠移植瘤的模型。 (二)分組及給藥：(1)對

13、照組：生理鹽水(含0.001％無水乙醇),腹腔內注射；(2)地塞米松組：1mg/kg,腹腔內注射；(3)紫杉醇組：20mg/kg,尾靜脈注射；(4)地塞米松+紫杉醇組：在其它三組給藥前12小時,預先給予地塞米松1mg/kg,腹腔內注射,然后給予紫杉醇20mg/kg,尾靜脈注射。三天一個療程共6個療程。 (三)觀察移植瘤的生長,繪制裸鼠移植瘤的生長曲線,實驗結束稱瘤體的重量,計算腫瘤生長抑制率。 (四)免疫組化分析:Bcl

14、-XL和Cleaved caspasc-3蛋白的表達,細胞增殖標記物Ki-67的表達。 (五)光鏡和透射電鏡下觀察組織形態(tài)和細胞超微結構改變。 結果： (一)在紫杉醇對SKOV-3裸鼠移植治療中,用地塞米松進行預處理后再用紫杉醇組,移植瘤的體積較單用紫杉醇組增大(P<0.01)。 (二)治療結束后稱瘤重,Dex+PTX治療組瘤重為0.79±0.09g,PTX組瘤重為0.50±0.08g,Dex+PTX組較

15、PTX組瘤重升高(P<0.01)。Dex+PTX組和PTX組抑制率分別為45.14％和65.28％,PTX組較Dex+PTX組抑制率大約增加18-25％。 (三)HE染色后,PTX治療組絕大部分細胞變大,細胞質較其它組明顯減少,細胞表現(xiàn)為空泡和凋亡特征。在Dex+PTX組中也有一些細胞表現(xiàn)為空泡和凋亡特征,但明顯少于PTX組。電鏡下Dex+PTX組和PTX組可見核固縮,染色質邊聚,凝集成塊等細胞凋亡征象,但Dex+PTX組中細胞

16、凋亡征象少于PTX組。 (四)免疫組化結果表明,Dex+PTX組與PTX組相比,在Dex+PTX組中Ki-67細胞增殖標記物、BcI-XL蛋白表達升高,Cleaved caspase-3蛋白表達降低,有顯著性差異,P<0.0125。 結論： (一)體內實驗證實地塞米松能降低紫杉醇對人卵巢癌SKOV-3裸鼠移植瘤治療效果。 (二)體內實驗證實地塞米松能拮抗紫杉醇誘導的人卵巢癌SKOV-3裸鼠移植瘤細胞凋亡,