紫杉醇耐受卵巢癌細胞亞株存在細胞骨架相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子上調(diào).pdf

1、研究背景卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，由于75％卵巢癌患者在初次診斷時已為晚期，化療成為與手術(shù)同樣重要的治療手段。雖然卵巢癌患者對當(dāng)今卡鉑-紫杉醇一線化療方案的初次反應(yīng)率高達80％，但是50％左右的患者在初次治療抑制后2至3年復(fù)發(fā)，并且再次治療不理想，最終死于藥物耐受。因此藥物耐受已成為臨床治療的主要障礙。 紫杉醇(paclitaxel，taxol)在細胞內(nèi)的作用靶點是細胞骨架——微管，通過促進微管聚合而干擾有絲分裂期紡

2、錘體功能，并激活紡錘體檢查點使有絲分裂停止，染色體分離失敗。目前對紫杉醇藥物耐受的研究主要關(guān)注于P-糖蛋白、微管蛋白亞型及微管結(jié)合蛋白表達的改變以及凋亡信號途徑異常等方面，但其耐藥機理仍不明確。 藥物耐受的形成是多步驟多基因共同作用的結(jié)果，可能涉及多個蛋白表達及功能的變化，以雙向電泳、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)為核心技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)為腫瘤藥物耐受研究提供了一個新的高通量技術(shù)平臺。它以蛋白質(zhì)組為研究對象，從細胞水

3、平動態(tài)分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。如今蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用到腫瘤分子生物學(xué)的研究中，而應(yīng)用于藥物耐受相關(guān)研究還處于起始階段，目前應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究卵巢癌紫杉醇耐受的相關(guān)蛋白國內(nèi)外均未見報道。 研究目的建立卵巢癌細胞株與其紫杉醇耐藥細胞亞株的差異蛋白表達圖譜，尋找與紫杉醇藥物耐受相關(guān)蛋白，并探索其作為臨床藥物耐受預(yù)示和逆轉(zhuǎn)靶

4、的可能性。 方法以人卵巢漿液性囊腺癌細胞株(SKOV3)和其紫杉醇穩(wěn)定耐藥細胞亞株(SKOV3-TR30)為研究對象。在總蛋白提取后，采用24cm，pH4-7的IPG膠條進行第一相等電聚焦，12％SDS-PAGE進行第二向電泳分離，凝膠銀染后用PDQuest軟件進行數(shù)據(jù)采集和圖像分析，建立SKOV3與SKOV3-TR30的蛋白質(zhì)組差異表達圖譜。差異表達蛋白采用LCQDecaXP型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行質(zhì)譜分析。利用質(zhì)譜分析

5、得到的原始數(shù)據(jù)，搜索IPI上的人非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(IPI.HUMAN.v3.07.fasta)從而鑒定蛋白。然后采用蛋白免疫印跡和免疫細胞化學(xué)方法對耐藥細胞及其親本細胞中的差異表達蛋白Sorcin、CathepsinB及HSP27進行定量和定位檢測。 結(jié)果經(jīng)過組內(nèi)與組間三次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)每次實驗均有相似變化的差異點23個。與親本細胞相比，在耐藥細胞中表達上調(diào)大于3倍的蛋白質(zhì)點有16個(P＜0.05)，在耐藥細胞中表達下調(diào)大于3

6、倍的蛋白質(zhì)點有7個(P＜0.05)。在23個差異表達的蛋白質(zhì)點中，我們選取圖象清晰、表達穩(wěn)定、位置固定且相對居中的蛋白點12個進行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索，其中7個蛋白點得到初步鑒定。分別為可溶性抗藥性相關(guān)鈣結(jié)合蛋白、組織蛋白酶B前體、調(diào)寧蛋白3、熱休克蛋白27、波形纖維蛋白、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶和血紅蛋白β鏈。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，Sorcin、CathepsinB及HSP27在紫杉醇耐藥細胞中的表達顯著高于相應(yīng)的親本細胞(P＜0.05