Fas Ligand和IL-1β在椎間盤細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、椎間盤(Intervertebral Disc，IVD)是脊柱運(yùn)動(dòng)功能單位中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。因椎間盤退變而導(dǎo)致的椎間盤退變性疾病(Degenerative Disc Disease，DDD)已成為現(xiàn)代社會(huì)中嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見病?，F(xiàn)有的治療方法均無(wú)法從根本上解決問(wèn)題，無(wú)論非手術(shù)治療還是手術(shù)治療，其臨床效果及預(yù)后均不能令人滿意。在保持脊柱力學(xué)結(jié)構(gòu)和生理完整性的前提下進(jìn)行椎間盤退變的治療，即在早期阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變，促進(jìn)椎間盤再生，

2、維持椎間盤處于一個(gè)正常的生理狀態(tài)無(wú)疑是最理想的。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，采用基因治療等分子生物學(xué)的方法阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變已成為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的很有應(yīng)用前景的方法。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是一種特異高效的基因沉默方法。目前已廣泛應(yīng)用于包括功能基因組學(xué)、藥物靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析以及疾病治療等諸多方面。因此，可以考慮將這一技術(shù)應(yīng)用于椎間盤退變的研究和治療。但要使這一治療方法能真正應(yīng)用到臨床，深入

3、全面地了解椎間盤退變的確切機(jī)制是前提。
　　 目前，有關(guān)椎間盤退變機(jī)制的相關(guān)研究涉及范圍已比較廣泛，如異常應(yīng)力、創(chuàng)傷、營(yíng)養(yǎng)障礙、炎癥反應(yīng)、生長(zhǎng)因子改變、蛋白酶類激活、遺傳因素等等可能均參與了椎間盤的退變過(guò)程。但是，其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。椎間盤細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)為深入認(rèn)識(shí)椎間盤退變的病理生理過(guò)程及確切發(fā)病機(jī)制提供了新的方向。部分學(xué)者樂(lè)觀地預(yù)測(cè)，抑制椎間盤細(xì)胞的凋亡有望防止或逆轉(zhuǎn)早期椎間盤退變的發(fā)生。
　　 Fas/Fas

4、L系統(tǒng)被認(rèn)為是椎間盤細(xì)胞凋亡的主要途徑。Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可分為以Caspase-8為關(guān)鍵因子的膜途徑和以Caspase-9為關(guān)鍵因子的線粒體途徑。FasL(Fas Ligand)作為配體與其受體Fas結(jié)合是激活Fas/FasL系統(tǒng)進(jìn)行凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始。然而，F(xiàn)asL作為一種細(xì)胞因子可能具有多重作用。在椎間盤中，F(xiàn)asL參與了椎間盤的發(fā)育和形成過(guò)程，作為分子屏障參與維持椎間盤的免疫豁免功能。FasL的高表達(dá)可能是對(duì)

5、椎間盤組織的一種保護(hù)，然而，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)FasL的高表達(dá)與椎間盤細(xì)胞的凋亡也密切相關(guān)。因此，有必要對(duì)FasL和椎間盤細(xì)胞的凋亡關(guān)系作更進(jìn)一步的研究。
　　 炎性環(huán)境可能會(huì)增加椎間盤細(xì)胞的凋亡。炎癥因子特別是IL-1β(Interleukin-1 Beta)在椎間盤退變過(guò)程中發(fā)揮了很大的促進(jìn)作用，涉及到諸多方面。它不僅能夠抑制椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成，加速其分解，而且還可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速椎間盤組織的破壞；最近研究還發(fā)現(xiàn)，IL-1

6、β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡也有影響。IL-1β不僅能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下椎間盤細(xì)胞的凋亡，而且還可以大大提高椎間盤細(xì)胞對(duì)FasL介導(dǎo)凋亡的敏感性。然而，IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用途徑尚不清楚，對(duì)提高FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性的原因也需要作進(jìn)一步研究。同時(shí)，對(duì)于椎間盤細(xì)胞的凋亡途徑，還存在一定分歧。然而，明確椎間盤細(xì)胞的具體凋亡途徑對(duì)于選擇阻斷這種過(guò)度凋亡的合適方法有著要重要的意義。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合RNA干擾的方法，分別

7、對(duì)FasL、IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用和途徑，以及IL-1β導(dǎo)致的椎間盤細(xì)胞對(duì)FasL介導(dǎo)的凋亡敏感性提高的原因進(jìn)行探討。目的在于明確FasL、IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用和途徑，探討能否利用RNAi手段阻斷椎間盤細(xì)胞凋亡，為將來(lái)利用分子生物學(xué)方法抑制椎間盤退變提供參考。
　　 第一部分、椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)和Fas、Caspase8-siRNA有效序列篩選
　　 目的：①探討SD大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核

8、交界區(qū)(InnerAnulus Fibrosus+Transitional Zone，IAF+TZ)細(xì)胞和髓核(Nucleus Pulposus，NP)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。②篩選化學(xué)合成的Fas-siRNA、Caspase8-siRNA沉默體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤細(xì)胞相應(yīng)基因的有效序列。
　　 方法：①用酶消化法分離培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤IAF+TZ細(xì)胞和NP細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察、甲苯胺藍(lán)、番紅O染色和II型膠原免疫組化鑒定確定培養(yǎng)細(xì)胞

9、類型。②將化學(xué)合成的siRNA利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000和Opti MEM I培養(yǎng)基以優(yōu)化轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入單層培養(yǎng)的椎間盤NP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后在不同時(shí)間點(diǎn)分別觀察細(xì)胞形態(tài)和活性，檢測(cè)mRNA及蛋白表達(dá)情況，判斷基因沉默效果。
　　 結(jié)論：①用酶消化法可成功培養(yǎng)出大鼠腰椎間盤細(xì)胞。②化學(xué)合成的Fas-siRNA、Caspase8-siRNA能對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤細(xì)胞相應(yīng)基因進(jìn)行有效沉默，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間

10、盤細(xì)胞可獲很高的轉(zhuǎn)染率和較好的基因抑制效果。
　　 第二部分、FasL對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用和途徑探討
　　 目的：探討FasL對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響，明確其凋亡途徑。
　　 方法：①將Fas-siRNA2轉(zhuǎn)染的原代大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的正常原代大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞，分別和含不同濃度FasL(0 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％胎牛血

11、清(1％ FBS)培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h，觀察FasL對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響，采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測(cè)Fas基因表達(dá)，Western Blot檢測(cè)Fas蛋白表達(dá)。②對(duì)和不同濃度FasL共培養(yǎng)的正常原代大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞的Fas、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3及Bid mRNA的表達(dá)水平，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-

12、3的酶活性以及線粒體膜電勢(shì)的變化進(jìn)行檢測(cè)。③利用RNAi沉默髓核細(xì)胞Caspase-8 mRNA對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)的膜途徑和線粒體途徑的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)論：①FasL具有直接誘發(fā)椎間盤髓核細(xì)胞凋亡和上調(diào)Fas表達(dá)的雙重作用。②FasL所誘發(fā)的椎間盤細(xì)胞凋亡主要通過(guò)膜途徑進(jìn)行，大劑量時(shí)可以激活線粒體途徑。③利用RNAi可降低FasL誘發(fā)的椎間盤細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分、IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用和途徑影

13、響
　　 目的：探討炎癥因子IL-1β對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響，明確其對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用途徑。
　　 方法：①用含不同濃度IL-1β(0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基分別和原代大鼠髓核細(xì)胞共培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、48 h)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的變化。②原代大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞和含不

14、同濃度IL-1β(0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h時(shí)，對(duì)Fas、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3及Bid mRNA的表達(dá)水平，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3的酶活性以及線粒體膜電勢(shì)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)論：①IL-1β可以誘導(dǎo)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞凋亡，其凋亡作用具有劑量、時(shí)間依賴關(guān)系。②IL-1β可以上調(diào)大鼠椎

15、間盤髓核細(xì)胞Fas的表達(dá)，從而影響髓核細(xì)胞的凋亡。③IL-1β主要通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)椎間盤髓核細(xì)胞凋亡，大劑量時(shí)可以激活膜途徑。④凋亡啟動(dòng)因素的不同會(huì)導(dǎo)致發(fā)生凋亡途徑的差異，不同的凋亡途徑之間存在相互交叉和相互影響。
　　 第四部分、IL-11β預(yù)刺激可增強(qiáng)FasL介導(dǎo)的椎間盤細(xì)胞凋亡的原因分析
　　 目的：明確IL-1β預(yù)刺激可增強(qiáng)FasL介導(dǎo)的大鼠椎間盤細(xì)胞凋亡的原因。
　　 方法：①離體培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤

16、內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞。②用陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞后，用含10 ng/mL IL-1β的1％FBS培養(yǎng)基和被轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在4h、8h、16h、32h等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)其對(duì)Fas表達(dá)的影響。③利用Fas-siRNA2和陰性對(duì)照siRNA分別對(duì)原代大鼠椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)分組和處理：共分5組，N、N-20ng、N-IL為陰

17、性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Si-20ng、Si-IL為Fas-siRNA2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。N為對(duì)照組，只加1％FBS培養(yǎng)基；N-20ng和Si-20ng在1％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時(shí)后，更換為含20 ng/ml FasL的1％FBS培養(yǎng)基；N-IL和Si-IL:與10ng/ml IL-1β在1％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)后，更換為含20ng/ml FasL的1％FBS培養(yǎng)基；以上各組加入20 ng/ml FasL后均繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞的

18、凋亡情況，Hochest33258染色和Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，RT-PCR、WesternBlot分別檢測(cè)Fas mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：①IL-1β通過(guò)改變Fas受體應(yīng)答狀態(tài)而提高椎間盤細(xì)胞對(duì)FasL的凋亡敏感性。②Fas siRNA可以降低IL-1β預(yù)刺激椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)FasL的凋亡敏感性。③利用RNAi可降低FasL誘發(fā)的椎間盤細(xì)胞過(guò)度凋亡，F(xiàn)as基因可以作為